牦牛GPX5基因CDS区的克隆和表达研究

朱江江，袁 梦，李鹏程，赵旺生*

（1.青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室，四川成都 610041；2.青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室，四川成都 610041；3.西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳 6210101）

附睾作为哺乳动物中精子成熟和储存的场所，在生殖过程中不可或缺。附睾上皮所形成的管腔环境和附睾管使精子在附睾运输过程中逐渐获得受精能力，在运输过程中精子质膜发生许多改变。附睾中适量的活性氧（ROS）水平是正常精子生理成熟和能力发育的关键。附睾管ROS 过多可引起氧化应激，破坏精子DNA 和大分子结构[1]。但精子本身的细胞质抗氧化剂水平较低，因此附睾中的抗氧化剂清除剂对精子有很好的保护作用，包括过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）[2]。

GPX5 是哺乳动物GPX 家族中一个与众不同的成员，与其他成员相比，GPX5 活性位点不含硒半胱氨酸（SeCys），而是半胱氨酸残基[3]，因此又被称为无关硒（Se）的GPX。GPX5 由附睾分泌，同GPX3 的含量超过总GPXs 的95%，存在于附睾液中[4]。GPX5基因对雄性生殖尤为重要。通过敲除GPX5基因的雄性小鼠模型研究显示，废除GPX5表达不仅导致附睾尾精子DNA 凝集降低，而且与之交配的雌鼠流产率以及幼鼠死亡率升高[5]。GPX5 能同精子质膜相结合，保护精子在附睾运输和尾腔储存过程中免受过氧化物的不利影响[6]。以上表明GPX5 在精子的抗氧化应激上有着重要作用。

GPXs 家族主要是以谷胱甘肽（GSH）为还原剂，催化H2O2形成水或将有机过氧化物进行相应的醇还原。GPX5同样具备该能力，从上皮细胞被释放到附睾腔后，它与精子头部结合，以GSH 作为底物对附睾中的过氧化氢和磷脂氢过氧化物进行催化，将附睾环境中ROS维持在一定浓度，减弱氧化应激影响[7]。氧化应激可导致生物分子的损伤和细胞功能的严重障碍。脂质过氧化尤其有害，其导致自由基扩增，损伤膜的完整性和功能，脂质过氧化产物是DNA 损伤的主要原因[8]。精子对附睾中ROS 水平尤为敏感，精子的细胞膜含有大量能被过氧化物损伤的多不饱和脂肪酸[9]。GPX5的存在极大程度减弱了氧化应激对精子的伤害[10]。

目前，有关GPX5基因在牦牛附睾中表达的未见详细研究。本研究利用克隆手段得到牦牛GPX5基因的CDS 区，并对其进行生物信息学分析和荧光定量检测其在附睾组织中的表达。

1 材料与方法

1.1 实验材料 从四川阿坝红原采集3 头年龄相近、体格相似、身体健康的公牦牛的睾丸。Hanks 溶液漂洗3 次，将附睾从睾丸中分割出来。把附睾分为附睾头、附睾颈和附睾尾3 部分，置于冻存管中，迅速放入液氮中以备用。

1.2 实验方法

1.2.1 提取总 RNA 和合成cDNA 第1 链利用Trizol 试剂分别提取附睾的头、颈和尾的总RNA，依靠QUAWELL超微量紫外分光光度计检测其浓度。以生工生物工程（上海）股份有限公司合成的M-MuLV 反转录试剂盒的步骤为操作依据，把总RNA 做模板，将cDNA 第1 链合成后置于冰箱-20℃中。

1.2.2 设计引物及克隆 以软件Primer Premier 5.0 设计牦牛GPX5的PCR 克隆的引物，GPX5-F：5'-ATGACTA TACAGTTAAGGGC-3'，GPX5-R：5'-TTATTTGGTTTT GAACTG-3'，以牦牛附睾组织反转录所得的cDNA 为模板，进行PCR 扩增，20 μL 体系：DNA 聚合酶mix（2×）10 μL，7.0 μL ddH2O，混合的上、下引物2.0 μL（10 μmol/L），再分别加入附睾不同部分组织的cDNA 1.0 μL（100 ng）。反应程序：预变性94℃4 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃60 s；共循环40 次，后经72℃进行2 min 的延伸。将产物电泳检测后进行DNA 的纯化并与目的片段和载体连接、进行转化及鉴定后，送于成都擎科梓熙生物公司进行测序。

1.2.3 生物信息学分析 利用生物信息学预测牦牛GPX5基因所编码的蛋白特性并分析其功能。利用软件BioXM 2.6 分析牦牛GPX5的核苷酸和氨基酸序列。利用在线软件EXPASY（https://web.expasy.org/protparam/）分析GPX5 蛋白质理化性质，登录NCBI 的BLAST 比对氨基酸同源性，选择 MEGA6.0 对其系统进化树进行构建。其他相关生物学的预测方法参考文献[11]。

1.2.4 荧光定量qPCR 软件Primer Premier 5.0 对基因GPX5及内参基因β-ACTIN的特异性的定量引物进行设计。GPX5-F：5'-ATGACTATACAGTTAAGGGC-3'和GPX5-R：5'-TTATTTGGTTTTGAACTG-3'；β-ACTIN-F：5'-AAGTTCTACAGTGTGGCCGA-3' 和β-ACTIN-R：5'-GACTGGCCCCTTCTCCTTAG-3'。荧光定量操作方法以生工的2XSG Fast qPCR Master Mix 试剂盒的说明书为标准。10 μL 体系：2xSG Fast qPCR Master Mix 5 μL，取混匀的上、下游引物0.8 μL，PCR-grade water 3.1 μL，模板DNA 为0.5μL，以每样3 个重复为对照。反应条件：预变性95℃3 min，95℃2 s，60℃25 s；40 个循环。

2 结果

2.1 牦牛附睾GPX5基因克隆产物 克隆结果显示，GPX5基因DNA 有730 bp。CDS 区分析发现，GPX5基因长度为630 bp，共编码了氨基酸209，起始密码为ATG，终止密码为TAA（图1）。

图1 牦牛GPX5 氨基酸排列图

2.2 GPX5 蛋白理化性质 EXPASY 分析表明，牦牛GPX5氨基酸分子式为C1105H1672N278O300S10，分子量为23.97 ku，总氨基酸数为209，占比最高的为亮氨酸，达 9.1%，其次为苯丙氨酸（8.6%）和谷氨酸（8.1%），色氨酸含量最低（1.4%）。其负电荷的残基总数（Asp+Glu）和正电荷残基总数（Arg+Lys）分别是20 和23，等电点为8.51，亲水系数（GRAVY）为-0.237，脂肪系数值是76.41，不稳定的系数是42.70，该蛋白不稳定。

2.3GPX5的同源性GPX5在BLAST 上同其他物种进行比对发现，山羊（XM_005696698.2）、绵羊（NM_001267883.1）、家 猪（NM_213886.1）、家 猫（XM_023254695.1)、仓鼠（NM_001256840.1）的同源性分别是95%、95%、90%、87%、86%。用MEGA6.0 将 以上物种的核苷酸序列进行系统进化树构建（图2），可知牦牛与山羊和绵羊的亲缘比较接近，这符合物种进化规律。

图2 GPX5 的进化树

2.4 牦牛GPX5基因的结构 利用NeTPhos 3.1 Server进行预测磷酸化位点的结果（图3）显示，丝氨酸有5个，酪氨酸有3 个，苏氨酸有6 个。由SOPMA 软件分析GPX5 的二级结构结果（图4）显示，GPX5 蛋白有73 个氨基酸在α螺旋区，为34.93%（73/209）；氨基酸有44 个在延伸链结构，为 18.18%（38/209）；21 个在β转角区，为8.13%（38/209）；无规则状态下的有81 个，为38.76%（81/209）。利用ProtScale 分析其亲疏水性（图5），最大值2.711 在第15 个位点处，最小值-2.644 在108 个位置上，GPX5 整体为亲水性，这与其理化性质预测相符。利用TMHMM 2.0 分析GPX5 蛋白的跨膜区（图6），可知GPX5 蛋白无跨膜的结构域。采用软件SignalP 4.1 Server 预测GPX5 信号肽（图7），最高值在22 位处，C 为剪切点分值 0.547，Y 为结合剪切点值 0.702，S 是信号肽值最高为0.964。由图7 可知，该蛋白存在信号肽，即为分泌蛋白。

图3 GPX5 蛋白的磷酸位点预测图

图4 牦牛GPX5 二级结构图

图5 牦牛GPX5 亲疏水预测图

图6 牦牛GPX5 结构域图

图7 预测牦牛GPX5 信号肽

2.5 牦牛附睾各组织的分析表达 附睾头、附睾颈、附睾尾的cDNA 进行qPCR 扩增并利用软件SigmaPlot 11.0 整理发现，GPX5在附睾头高水平表达，且表达量显著高于附睾颈和附睾尾（图8）。

图8 牦牛附睾GPX5 的表达

3 讨 论

GPX5首次从小鼠附睾中被发现[12]，在附睾中的表达同附睾特异性转录因子、睾丸因子、成纤维细胞生长因子等有关，还受雄激素的控制[4]。尽管GPX5作为无硒的GPX，但已有研究证实，其与GPXs 其他家族成员一样具有催化活性[13]，并作为磷脂过氧化氢酶在抗氧化防御中发挥重要的生理作用[14]。在缺硒的小鼠体内发现，GPX5mRNA 表达水平的增加可弥补GPX下降的活性，亦可间接证明GPX5的功能[15]。同时，精液中GPX5含量也与精子质量有关。Barranco 等[16]在猪精液研究中发现，低精子质量组的GPX5含量高于高精子质量组。由此推测低质量精子更容易受到氧化损伤，而高水平的GPX5可以弥补这种高敏感性。此外，精液中GPX5含量同精子膜的完整性及运动参数呈负相关[16]。这都说明GPX5与雄性哺乳动物的生殖能力密切相关。本研究克隆获得牦牛GPX5序列长730 bp，CDS 区有630 bp，编码氨基酸为209 个。GPX5的亲缘距离是从偶蹄目到食肉目和啮齿目。进化树演变同动物分类学规律演变一致。因其负电值比正电值小，即蛋白质带正电；且GRAVY 为负值，因此牦牛GPX5编码的是带正电的不稳定亲水蛋白。本研究发现，该蛋白的磷酸化位点共有14 个，为研究其磷酸化指明方向，同时蛋白结构以α螺旋和无规则为主，并在此基础上进行延伸。TMHMM 2.0 预测其跨膜域时，未发现存在跨膜区域，但用SignalP 4.1 发现该蛋白有信号肽的存在，即存在于细胞器基质或细胞质基质的分泌蛋白。荧光定量结果分析发现，GPX5在牦牛附睾头中高表达，这与小尾寒羊[17]附睾的研究相符，在羊整个附睾中均检测到GPX5，但附睾头组织中GPX5水平明显高于体和尾。在牛附睾头中亦高水平表达[18]。Rejrari 等[19]发现，附睾中的GPX5有3 种存在方式，分别为可溶性附睾液蛋白，精子质膜结合蛋白，结合脂质并对其催化蛋白，他们都具有保护精子的作用；而在附睾尾，GPX5大多与精子结合，游离的较少。总之，GPX5对精子的保护作用不容忽视，其能避免氧化应激对精子的刺激，有利精子DNA 完整性的保持，保证精子质量和提高受精率。以上研究说明，GPX5在附睾中具有重要意义，在附睾头中的表达量最高，其蛋白可通过附睾上皮细胞质表达，分泌到附睾腔内，以弥补未成熟精子的先天性抗氧化酶的缺乏[20]。同时，GPX5除具有抗氧化作用外，GPX5亦能对精子活力和顶体反应产生影响。Barranco 等[16]研究发现，与低浓度的GPX5 相比，高浓度的GPX5 猪精浆可延缓精子活力下降率，人工授精后的分娩率及产仔率较高，表明精子活力和繁殖力与在精浆中的GPX5含量呈正相关。有研究表明，GPX5能同附睾精子顶体区的脂质过氧化物相结合，从而防止脂质过氧化物和磷脂酶相互作用引起的顶体反应[21]。综上，GPX5在附睾中有保护精子避免进行早熟顶体反应及对精子受精能力的维持作用，且研究哺乳动物附睾中的GPX5对探索雄性生殖生理的机理具有重要意义。

4 结 论

本研究成功克隆牦牛GPX5基因，同时发现GPX5蛋白为不稳定的，带正电具有亲水性，且无跨膜结构域但却是分泌性的蛋白；经过qPCR 技术检测，GPX5在牦牛附睾组织表达分布不均，附睾头的表达明显高于附睾颈和附睾尾。本研究初步对牦牛的GPX5进行了探索，为后续继续研究牦牛GPX5的功能奠定基础。