制首乌含药血清对人乳腺癌T-47D细胞增殖及ER表达的影响

朱璨 王嫣 李尧锋 田敏 唐文超 杨长福 王和生

中圖分类号 R285.5 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）22-3062-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.22.08

摘 要 目的：研究制首乌含药血清对人乳腺癌T-47D细胞增殖及雌激素受体（ER）表达的影响，探讨其植物雌激素（PE）样作用。方法：将性未成熟SD大鼠随机分为空白组，戊酸雌二醇（Ev）组（阳性对照，0.12 mg/kg），制首乌低、高剂量组（0.75、3 g/kg，以生药量计）以及制首乌低、高剂量+Ev联用组（剂量同各药单用组），每组10只。空白组大鼠灌胃等体积水，各给药组大鼠灌胃相应药物，早晚各1次，连续4 d。末次给药2 h后采血，制备空白血清和含药血清。将T-47D细胞随机分为空白组，Ev组，制首乌低、高剂量组以及制首乌低、高剂量+Ev联用组，分置于含20%空白或相应含药血清的培养基中培养，采用CCK-8法检测各组细胞的增殖率（PR），采用Western blotting法和逆转录-聚合酶链反应法检测ER-α、ER-β蛋白及其mRNA的表达情况。结果：与空白组比较，各给药组细胞的PR[各给药组（24 h），除制首乌高剂量+Ev联用组外的其余各给药组（48、72 h）]均显著升高;且制首乌高剂量组（72 h）显著高于Ev组，制首乌低剂量组+Ev联用组（72 h）显著高于同剂量制首乌单用组，而制首乌高剂量+Ev联用组（72 h）显著低于同剂量制首乌单用组（P<0.05或P<0.01）。Ev组、制首乌高剂量组和制首乌低剂量+Ev联用组细胞中ER-α蛋白，各给药组细胞中ER-α mRNA和ER-β蛋白以及Ev组、制首乌低剂量组和制首乌+Ev联用组细胞中ER-β mRNA的相对表达量均显著升高;Ev组细胞中ER-α蛋白及其mRNA的相对表达量均显著高于制首乌单用和联用组;Ev组细胞中ER-β蛋白及其mRNA的相对表达量均显著低于制首乌低剂量+Ev联用组，但ER-β mRNA的相对表达量显著高于制首乌单用组和制首乌高剂量+Ev联用组;制首乌低剂量+Ev联用组细胞中ER-α、ER-β蛋白及其mRNA以及制首乌高剂量+Ev联用组细胞中ER-β mRNA的相对表达量均显著高于同剂量制首乌单用组，而制首乌高剂量+Ev联用组细胞中ER-α蛋白及其mRNA相对表达量均显著低于同剂量制首乌单用组（P<0.05或P<0.01）。结论：制首乌含药血清可促进人乳腺癌T-47D细胞的增殖，并可通过促进ER-α和ER-β蛋白及其mRNA的表达来发挥PE样作用。但上述作用弱于雌激素，且两者联合可能会拮抗雌激素的作用。

关键词 制首乌;含药血清;T-47D细胞;细胞增殖;雌激素受体;植物雌激素样作用

Effects of Processed Polygonum multiflorum Containing Serum on the Proliferation and the Expression of ER of Human Breast Cancer T-47D Cells

ZHU Can1，WANG Yan1，LI Yaofeng1，TIAN Min2，TANG Wenchao1，YANG Changfu1，WANG Hesheng1（1. College of Basic Medicine， Guizhou University of TCM， Guiyang 550025， China; 2. College of Pharmacy， Guizhou University of TCM， Guiyang 550025， China）

ABSTRACT   OBJECTIVE： To study the effects of processed Polygonum multiflorum containing serum on the proliferation and the expression of estrogen receptor （ER） of human breast cancer T-47D cells， and to investigate its phytoestrogen （PE）-like effect. METHODS： Sexually immature SD rats were randomly divided into estradiol valerate （Ev） group （positive control， 0.12 mg/kg）， processed P. multiflorum low-dose and high-dose groups （0.75， 3 g/kg， by crude drug）， low-dose and high-dose processed P. multiflorum+Ev groups （same dose as single drug group）， with 10 rats in each group. Blank group was given constant volume of water intragastrically， and administration groups were given relevant medicine intragastrically; once day and night， for consecutive 4 days. Two hours after last administration， blank serum and containing serum were prepared. T-47D cells were also randomly divided into blank group， Ev group， low-dose and high-dose processed P. multiflorum groups， low-dose and high-dose processed P. multiflorum+Ev groups， and then were cultured in medium which contained 20% blank serum or drug containing serum. CCK-8 assay was used to detect proliferation rate （PR）. Western blotting assay and RT-PCR were used to detect the protein and mRNA expression of ER-α and ER-β. RESULTS： Compared with blank group， PR of administration groups [each administration group （24 h）， other administration groups （48， 72 h） except for high-dose processed P. multiflorum+Ev group] were increased significantly; high-dose processed P. multiflorum group （72 h） was significantly higher than Ev group， and low-dose processed P. multiflorum+Ev group （72 h） was significantly higher than the same-dose processed P. multiflorum group; high-dose processed P. multiflorum+Ev group （72 h） was significantly lower than the same-dose processed P. multiflorum group （P<0.05 or P<0.01）. Relative protein expression of ER-α in Ev group， high-dose processed P. multiflorum group and low-dose processed P. multiflorum+Ev group， relative mRNA expression of ER-α and protein expression of ER-β in administration groups， relative mRNA expression of ER-β in Ev group， low-dose processed P. multiflorum group and processed P. multiflorum+Ev groups were all increased significantly. Relative protein and mRNA expression of ER-α in Ev group were significantly higher than processed P. multiflorum groups and combination groups. Relative protein and mRNA expression of ER-β in Ev group were significantly lower than low-dose processed P. multiflorum+Ev group， but relative mRNA expression of ER-β was significantly higher than processed P. multiflorum groups and high-dose processed P. multiflorum+Ev group. Relative protein and mRNA expression of ER-α and ER-β in low-dose processed P. multiflorum+Ev group as well as relative mRNA expression of ER-β in high-dose processed P. multiflorum+Ev group were significantly higher than the same-dose processed P. multiflorum group. Relative protein and mRNA expression of ER-α in high-dose processed P. multiflorum+Ev group were significantly lower than the same-dose processed P. multiflorum group （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： The processed P. multiflorum containing serum can promote the proliferation of human breast cancer T-47D cells， and play the PE-like role through promoting protein and mRNA expression of ER-α and ER-β. However， the above effects are weaker than estrogen， and the combination of the two may antagonize the effect of estrogen.

KEYWORDS   Processed Polygonum multiflorum; Containing serum; T-47D cells; Cell proliferation; Estrogen receptor; Phytoestrogen-like effect

何首乌为蓼科植物何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.）的干燥块根，其炮制品制首乌（Polygoni multiflori radix preparata）具有补肝肾、益精血、壮筋骨、乌须发之功效[1]。现代药理研究表明，制首乌具有植物雌激素（PE）样作用，可抗衰老、抗骨质疏松，预防和延缓卵巢颗粒细胞凋亡，阻止卵泡闭锁[2-3]。本课题组前期研究发现，制首乌可调节去卵巢大鼠的生殖轴，亦能抑制雷公藤多苷对大鼠生殖功能的破坏作用[4-5];同时在体研究表明，制首乌主要成分二苯乙烯苷能升高性未成熟小鼠的子宫系数，上调其子宫雌激素受体（ER-α、ER-β）的表达[6]。为进一步探讨制首乌的PE样活性及可能机制，本课题采用中药血清药理学实验方法，以制首乌含药血清为干预物，考察其对体外培养的雌激素受体阳性[ER（+）]人乳腺癌T-47D细胞增殖和ER-α、ER-β蛋白及其mRNA表达的影响，旨在为制首乌PE药物研发以及临床应用提供参考。

1 材料

1.1 仪器

BB15型CO2培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）;Eclipse TS100型倒置显微镜（日本Nikon公司）;Synergy 2型荧光/吸收光酶标仪（美国Bio-Tek公司）;Mini-Protean Tetra型电泳槽、C1000 Touch Thermal Cycler型聚合酶链反应（PCR）仪、ChemicDoc Touch型超高灵敏化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司）;Nano Photometer-N80型超微量分光光度计（德国Implen公司）;Microfuge 20R型高速冷冻离心机（美国Beckman公司）。

1.2 药材、药品与试剂

制首乌饮片（四川省川源药业有限公司，批号：171001）经贵阳中医药大学药学院王世清教授鉴定为制首乌真品，各项质控指标均符合2015年版《中国药典》（一部）的相关要求[1]。

戊酸雌二醇片（Ev，阳性对照，德国Jenapharm GmbH & Co. KG，规格：1 mg）;DMEM高糖培养基、DMEM高糖无酚红培养基、胰蛋白酶（美国Gibco公司）;胎牛血清（FBS）、活性炭-葡聚糖苷处理的胎牛血清（CDT-FBS）（以色列Biological Industries公司）;青链霉素双抗、CCK-8试剂盒（批号：013018181008）、细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒、QuickblockTM封闭液（上海碧云天生物技术公司）;兔源ER-α单克隆抗体、兔源β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体（内参）（美国CST公司，批号分别为6、4）;兔源ER-β多克隆抗体（美国Abcam公司，批号：GR3211677-6）;山羊抗兔IgG二抗（美国Jackson Immuno Research公司，批号：139799）;TRNzol Universal總RNA提取试剂盒、FastKing一步法逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒[含FastKing One Step RT-PCR Master Mix、RT-PCR Enzyme Mix、无RNA酶ddH2O等试剂，天根生化科技（北京）有限公司];PCR引物（序列见表1）由上海生工生物工程有限公司设计、合成;其余试剂均为分析纯，水为双蒸水。

1.3 动物

SPF级SD大鼠60只，雌性，出生21 d（刚断乳、性未成熟），体质量60～80 g，购自重庆市中药研究院实验动物研究所，动物使用许可证号：SYXK（渝）2017-0003。

1.4 细胞

ER（+）人乳腺癌T-47D细胞由上海复祥生物科技有限公司提供。

2 方法

2.1 制首乌水煎液的制备

取制首乌饮片60 g，加5倍量（g/mL，下同）水浸泡30 min，煎煮至微沸，保持20 min，滤过;再加3倍量水，同法煎煮，滤过;合并两次滤液，浓缩，制得每1 mL含生药0.3 g的水煎液，经微孔滤膜滤过后，将滤液置于4 ℃保存，备用。

2.2 动物分组与给药

参考文献方法[7]，将大鼠随机分为6组，即空白组，Ev组，制首乌低、高剂量组以及制首乌低、高剂量+Ev联用组，每组10只。空白组大鼠灌胃等体积水，Ev组大鼠灌胃Ev 0.12 mg/kg（以水为溶剂，剂量根据人用临床等效剂量换算而得），制首乌低、高剂量组大鼠分别灌胃“2.1”项下制首乌水煎液0.75、3 g/kg（以生药量计，以水为溶剂，剂量参照人用等效剂量和本课题组前期预实验结果设置），制首乌低、高剂量+Ev联用组大鼠按上述单用剂量灌胃相应药物;给药体积均为1 mL/100 g，早晚各1次，连续4 d。

2.3 含药血清的制备

末次给药2 h后，麻醉各组大鼠，于腹主动脉取血，室温静置1 h，以2 000 r/min离心10 min，分离上层血清。合并同组大鼠血清，即得空白血清和含药血清，于56 ℃下灭活补体30 min，经0.22 μm微孔滤膜滤过后，将滤液置于-20 ℃保存，备用。

2.4 细胞增殖情况检测

采用CCK-8法检测。将人乳腺癌T-47D细胞置于含10%FBS、1%青链霉素双抗的DMEM高糖培养基中，于37 ℃、5%CO2、相对饱和湿度条件下培养（下同），于后续试验开始前3 d，将培养基更换为含5%CDT-FBS、1%青链霉素双抗的DMEM高糖无酚红培养基，以增加细胞对雌激素样物质的敏感性[8]。取上述经预处理且处于对数生长期的T-47D细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）清洗，经0.25%胰蛋白酶消化后，以3×103个/孔接种于96孔板中，每孔加入含5%CDT-FBS、1%青链霉素双抗的DMEM高糖无酚红培养基150 μL，培养24 h待细胞贴壁后，将细胞随机分为空白组、Ev组和制首乌低、高剂量组以及制首乌低、高剂量+Ev联用组，每组设6个复孔。吸弃各孔上清液，空白组加入含1%青链霉素双抗、20%空白血清（“2.3”项）的DMEM高糖无酚红培养基150 μL，各给药组分别加入含1%青链霉素双抗、20%相应含药血清（“2.3”项）的DMEM高糖无酚红培养基150 μL，分别培养24、48、72 h，在各时间点分别加入CCK-8试剂15 μL，于37 ℃孵育2 h，使用荧光/吸收光酶标仪于450 nm波长处检测各孔的吸光度（A），并计算增殖率（PR），PR=（试验组细胞平均A值/空白组细胞平均A值）×100%。上述试验重复3次（下同）。

2.5 细胞中ER-α、ER-β蛋白表达情况检测

采用Western blotting法检测。取“2.4”项下经预处理且处于对数生长期的T-47D细胞，用PBS清洗，经0.25%胰蛋白酶消化后，以1×106个/孔接种于6孔板中，每孔加入含5%CDT-FBS、1%青链霉素双抗的DMEM高糖无酚红培养基2 mL，培养24 h待细胞贴壁后，按“2.4”项下方法分组、给药，每组设3个复孔。培养48 h后收集细胞，经细胞裂解液裂解后，吸取裂解液适量，于4 ℃下以12 000 r/min离心15 min，取上清液，按BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行蛋白定量。经5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液稀释后，于100 ℃变性5 min。每组取变性蛋白20 μg进行SDS-PAGE电泳（电压：120 V，时间：60 min），电泳结束后转移至PVDF膜上，以封闭液室温封闭15 min，加入相应一抗（稀释度均为1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜;用TBST溶液清洗10 min×3次，随后加入二抗（稀释度均为1 ∶ 10 000），室温孵育1 h;用TBST溶液清洗10 min×3次，以ECL显色后，采用超高灵敏化学发光成像系统成像并使用Image-Pro Express 5.1图像处理软件分析。以相应蛋白与内参β-actin条带的灰度值比值作为目标蛋白的相对表达量。

2.6 细胞中ER-α、ER-β mRNA表达情况检测

采用RT-PCR法检测。取“2.4”项下经预处理且处于对数生长期的T-47D细胞，按“2.5”项下方法培养、分组、给药，每组设3个复孔。培养48 h后收集细胞，采用TRNzol Universal总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，使用超微量分光光度计测定其纯度（即A260 nm/A280 nm值，若A260 nm/A280 nm值为1.8～2.0即表明其纯度符合要求[9]）。参照FastKing一步法RT-PCR试剂盒说明书进行RT-PCR，反应体系（50 ?L）：总RNA 2 ?L、2×FastKing One Step RT-PCR Master Mix 25 ?L，25×RT-PCR Enzyme Mix 2 ?L、上/下游引物各1.25 ?L、无RNA酶ddH2O 18.5 ?L。反应条件：42 ℃逆转录30 min，95 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循环35次;72 ℃再延伸5 min。扩增产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳（电压：120 V，时间：45 min）后，采用超高灵敏化学发光成像系统成像并使用Image Lab 5.2.1软件进行分析，以相应基因与内参β-actin条带的灰度值比值作为目标基因mRNA的相对表达量。

2.7 统计学方法

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。计量资料均以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。P<0.05為差异有统计学意义。

3 结果

3.1 制首乌含药血清对T-47D细胞增殖的影响

作用24 h时，各给药组细胞的PR均较空白组显著升高（P<0.05）。作用48、72 h时，除制首乌高剂量+Ev联用组外，其余各给药组细胞的PR均较空白组显著升高（P<0.05或P<0.01）;且在作用72 h时，制首乌高剂量组细胞的PR显著高于Ev组，制首乌低剂量+Ev联用组细胞的PR显著高于同剂量制首乌单用组，而制首乌高剂量+Ev联用组细胞的PR显著低于同剂量制首乌单用组（P<0.05），详见表2。

3.2 制首乌含药血清对T-47D细胞中ER-α、ER-β蛋白表达的影响

与空白组比较，Ev组、制首乌高剂量组、制首乌低剂量+Ev联用组细胞中ER-α蛋白以及各给药组细胞中ER-β蛋白的相对表达量均显著升高;且Ev组细胞中ER-α蛋白的相对表达量显著高于制首乌单用及联用组，而ER-β的相对表达量显著低于制首乌低剂量组+Ev联用组;制首乌低剂量+Ev联用组细胞中ER-α、ER-β蛋白的相对表达量均显著高于同剂量制首乌单用组，而制首乌高剂量+Ev联用组ER-α蛋白的相对表达量显著低于同剂量制首乌单用组（P<0.05或P<0.01），详见图1、表3。

3.3 制首乌含药血清对T-47D细胞中ER-α、ER-β mRNA表达的影响

与空白组比较，各给药组细胞中ER-α mRNA以及Ev组、制首乌低剂量组和制首乌+Ev联用组细胞中ER-β mRNA的相对表达量均显著升高，且制首乌单用及联用组细胞中ER-α mRNA以及制首乌单用组、制首乌高剂量+Ev联用组细胞中ER-β mRNA的相对表达量均显著低于Ev组，而制首乌低剂量+Ev联用组细胞中ER-β mRNA的相对表达量显著高于Ev组;制首乌低剂量+Ev联用组细胞中ER-α、ER-β mRNA以及制首乌高剂量+Ev联用组细胞中ER-β mRNA的相对表达量均显著高于同剂量制首乌单用组，而制首乌高剂量+Ev组ER-α mRNA的相对表达量显著低于同剂量制首乌单用组（P<0.05或P<0.01），详见图2、表3。

4 讨论

T47-D细胞是ER（+）人乳腺癌细胞株，富含ER，可受雌激素或雌激素样活性物质诱导而增殖，是用以检测雌激素样活性的常用细胞株[10-11]。雌激素受体主要包括ER-α和ER-β两种亚型，其中ER-α主要高表达于子宫、睾丸等组织，且总体活性高于ER-β[12-15]。

制首乌是传统补益中药，能补肝肾、益精血，本课题组前期研究发现制首乌及其活性成分在体内具有PE样作用[6]。考虑到制首乌成分复杂、须经血液循环分布和消化道吸收才能发挥相应作用[7]，故本研究采用中药血清药理学方法，制备制首乌含药血清，并将其直接作用于T-47D细胞，初步探讨制首乌的PE样作用及可能机制。以含药血清为干预药物既可排除制首乌粗提物（如水煎剂）理化性质对体外研究的影响，也可真实反映药物经在体消化、吸收和生物转化后的药效发挥过程[7]。与此同时，本研究还考察了制首乌与Ev联用对细胞ER表达的影响，以进一步探讨制首乌的双重调节作用。

CCK-8试验结果显示，作用24 h时，各给药组细胞的PR均较空白组显著升高。作用48、72 h时，除制首乌高剂量+Ev联用组外，其余各给药组细胞的PR均较空白组显著升高;且在作用72 h时，制首乌高剂量组细胞的PR显著高于Ev组，制首乌低剂量+Ev联用组细胞的PR显著高于同剂量制首乌单用组，而制首乌高剂量+Ev联用组细胞的PR显著低于同剂量制首乌单用组。这提示Ev和制首乌均能明显促进T-47D细胞的增殖。当单用制首乌时，这种促增殖作用有随剂量增加而逐渐增强的趋势，且在作用72 h时，高剂量制首乌的作用明显强于阳性对照Ev;当制首乌与Ev联用时，这种促增殖作用有随剂量增加而逐渐减弱的趋势，且在作用72 h时，低剂量联用组的作用明显强于低剂量单用组，而高剂量联用组的作用则明显弱于高剂量单用组，表明低剂量制首乌与Ev联合具有协同作用，而高剂量制首乌与Ev联合则具有拮抗作用。这可能与PE在体内的双重调节作用有关，即当体内雌激素水平较低时，PE可与ER结合发挥雌激素样作用;而当体内雌激素水平较高时，PE则可通过竞争性结合ER而产生抗雌激素作用[16]。但本研究并未考察Ev联用剂量的影响，故上述结论有待进一步证实。

本研究结果显示，Ev和制首乌均可不同程度地增加ER-α、ER-β蛋白及其mRNA的表达。其中，Ev组、制首乌高剂量组和制首乌低剂量+Ev联用组细胞中ER-α蛋白，各给药组细胞中ER-α mRNA和ER-β蛋白，Ev组、制首乌低剂量组以及制首乌+Ev联用组细胞中ER-β mRNA的相对表达量均较空白组显著升高;Ev组细胞中ER-α蛋白及其mRNA的相对表达量均显著高于制首乌单用和联用组;Ev组细胞中ER-β蛋白及其mRNA的相对表达量显著低于制首乌低剂量+Ev联用组，但其ER-β mRNA的相对表达量显著高于制首乌单用组和制首乌高剂量+Ev联用组。这提示Ev的促增殖作用较制首乌更强，与文献报道的制首乌PE样作用弱于雌激素这一观点基本相符[16];同时，制首乌高剂量+Ev联用虽能明显上调T-47D细胞中ER-α mRNA的表达，但对ER-α蛋白表达的影响却不明显，可能与翻译过程中转录因子的表达有关[17-18]，但具体机制尚需进一步探索。此外，制首乌低剂量+Ev联用组细胞中ER-α、ER-β蛋白及其mRNA以及制首乌高剂量+Ev联用组ER-β mRNA的相对表达量均显著高于同剂量制首乌单用组，而制首乌高剂量+Ev联用组细胞中ER-α蛋白及其mRNA相对表达量均显著低于同剂量制首乌单用组。这进一步揭示了不同剂量制首乌与Ev联用促增殖作用的差异，即低剂量制首乌与Ev联合后，对ER-α蛋白及其mRNA表达的上调具有协同作用;而高剂量制首乌与Ev联合则呈拮抗作用。但与同剂量制首乌单用比较，不同剂量制首乌与Ev联用均可促进ER-β mRNA的表达，但高剂量制首乌与Ev联用对ER-β蛋白表达的影响则不明显，这可能与设计ER-β mRNA引物序列时未包含变异片段、而高剂量制首乌单用能誘导引物序列某些片段的扩增有关[19-20]。

综上所述，制首乌含药血清可促进人乳腺癌T-47D细胞的增殖，并可通过促进雌激素受体ER-α和ER-β蛋白及其mRNA的表达来发挥PE样作用。但上述作用弱于雌激素，且两者联合可能会拮抗雌激素的作用。此外，RT-PCR试验结果提示制首乌PE样作用的分子机制可能与Ev有所不同，故仍有待后续研究深入探讨。

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