紫娟绿茶化学成分与抗氧化活性相关性研究

刘倩葶，念波，石兴云，焦文文，蒋宾，张正艳，周玲霞，马燕，陈立佼，蒋勋，王兴华，赵明,2,3*

1.云南农业大学龙润普洱茶学院，650201；2.云南农业大学云南省药用植物生物学重点实验室，650201；3.云南农业大学西南中药材种质创新与利用国家地方联合工程研究中心，650201；4.普洱市茶叶科学研究所，665000；5.普洱茶树良种场，665000

茶树新梢一般为黄绿色，但在群体品种茶园中，容易发生红紫化叶色突变。目前中国[1-2]、日本[3]、肯尼亚[4-7]和印度[8]等国家都有发现新梢紫化或红化的栽培品种，如“紫娟”[9]和“Sunrouge tea”等品种。其中，由云南省农业科学院茶叶研究所培育而成的新梢呈紫色的品种“紫娟”，是茶树叶色红紫化突变的典型代表之一，所制烘青绿茶的干茶和茶汤均为紫色，已经成为我国一个重要的特种茶树良种[10]。

花青素是茶叶中多酚类化合物之一，在茶叶中的含量为0.01%左右[11]。研究发现，茶树叶色红紫色突变的主要原因是其富含花青素或花色苷成分。例如，萧力争等[12]研究发现花青素含量与红紫色突变芽叶的紫色深浅程度密切相关，芽叶紫色程度越深，花青素含量越高。此外，梁名志[13]、杨兴荣[14]、费旭元[15]、王秋萍[16]、许燕[17]等都对“紫娟”茶中的花青素含量进行了研究。尽管上述各研究在测定的花青素或花色苷含量与组成方面略有不同，但研究结果基本揭示了紫娟茶中的花青素含量要高于一般黄绿色茶叶，其一芽二叶花青素含量可高达29.14 mg/g[14]。此外，王帅[18]、费旭元[15]、李燕丽[19]、龚加顺[20]和Jiang[21]等研究分析了紫娟茶中的花色苷组成，目前已经鉴定出了飞燕草-3-半乳糖苷 （Delphinidin 3-O-β-D-galactoside chloride）、矢车菊-3-半乳糖苷（Cyanidin 3-O-galactoside chloride）、天竺葵色素-3,5-二葡萄糖苷（Pelargonidin 3,5-diglucoside）等花色苷成分。

富含花青素的紫娟茶具有很大的开发价值。紫娟中既含有儿茶素、茶氨酸、咖啡碱等茶叶中常见的生物活性成分，同时也富含具有多种生理功能的花青素成分，这为其具有的保健功能奠定了重要的化学物质基础。国内外学者研究发现，紫娟茶具有多种保健功能，例如抗炎和抗肿瘤[22]、降压[23-24]、抑菌[25]、预防炎症[26]及治疗阿尔兹海默症[27]等。此外，戴妙妙等[28-29]研究发现，同等浓度条件下，紫娟茶花色苷对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的捕获能力高于BHA和BHT，清除ABTS+阳离子自由基的能力高于BHT，低于BHA。

抗氧化物质可以清除呼吸（氧化反应）、外界污染、放射线照射等因素产生的自由基[30]。花青素和儿茶素等被认为是紫娟茶中重要的抗氧化活性物质。不同紫娟茶类中紫娟绿茶抗氧化活性最强[31]。初步研究表明，其总抗氧化活性与其茶多酚和儿茶素含量呈显著的正相关，其清除DPPH自由基活性与其花青素含量呈显著正相关[32]。

为此，本文以同一批紫娟鲜叶为原料，分别加工成烘青、炒青、晒青和蒸青4种类型的绿茶，分别测定茶样中的花青素、黄酮类和儿茶素等物质，并分析生化成分含量与抗氧化活性之间的相关性，以期为进一步探究紫娟茶中抗氧化活性物质等提供科学依据。

一、材料与方法

1.材料、主要仪器以及主要试剂

（1）茶叶加工

紫娟茶树鲜叶采自云南省普洱市普洱茶树良种场，采摘标准为一芽二叶，按照图1所示方法，分别加工成烘青、炒青、晒青、蒸青4种绿茶。

（2）主要试剂

DPPH（HPLC级，上海源叶生物科技有限公司）、总抗氧化（T-AOC）和羟自由基试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

飞燕草色素（Dp）、矢车菊色素（Cy）、牵牛花色素（Pt）、天竺葵色素（Pg）、芍药色素（Pn）、锦葵色素（Mv）、儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、鞣花酸（EA）、没食子酸（GA）、1,4,6-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖（GG）、咖啡碱（CA）和黄酮类化合物木犀草素（Lu）、杨梅素（My）、槲皮素（Qu）、山奈酚（Kf）均购自成都曼思特生物科技有限公司。准确称取计算量的各单体对照品10.00 mg，用甲醇充分溶解并定容至10 mL，摇匀后得到1.00 mg/mL的各单体储备液，放于-80℃冰箱保存，用时根据需要混合或用甲醇进行稀释。

（3）主要仪器

1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）、SHZ-DIII予华牌循环式真空泵（上海市崇明实验仪器厂）、X-5紫外可见光分光光度计（上海元析仪器有限公司）、Smart-Q30试验超纯水器（上海和泰仪器有限公司）、6CST-30滚筒杀青机（浙江上洋机械有限公司）、6CR-30茶叶揉捻机（浙江上洋机械有限公司）、6CZ全自动蒸茶机（云南省包装食品机械厂）、BS-CG茶叶电炒锅（山东秉盛重工机械有限公司）、ATH-206B茶叶烘焙机（福建佳友机械有限公司）。

2.试验方法

（1）化学成分测定

图1 4种紫娟绿茶的加工方法

参照《茶 水浸出物测定》（GB/T 8305—2013）[33]测定水浸出物（WE）含量；使用茚三酮比色法[34]、酒石酸亚铁比色法[35]和硫酸蒽酮比色法[36]测定游离氨基酸（AA）总量、茶多酚（TP）和可溶性糖（SS）含量；使用高效液相色谱法（HPLC） 测定茶叶花青素 （Dp、Cy、Pt、Pg、Pn、Mv）的含量[37]；HPLC方法测定儿茶素（C、EC、EGC、ECG、EGCG）、GA、GG 和 CA[38]、EA、黄酮类化合物（Lu、Kf、My、Qu）含量[39]。

（2）抗氧化活性测定

紫娟茶样液制备：精密称取磨碎茶样1.00 g，加45 mL沸蒸馏水，移入沸水浴浸提45 min（每隔10 min摇1次），趁热过滤至50 mL容量瓶，滤渣用少量沸水冲洗数次，冷却后定容，所得茶汁稀释至适合浓度，供待测用。

精密吸取2 mL已经配置好的0.04 mg/mL的DPPH无水乙醇溶液和2 mL无水乙醇于试管中，充分摇匀后避光反应15 min，用无水乙醇作为空白对照，在波长517 nm处测定吸光值，记为A0；用样品稀释液代替无水乙醇，其余操作同上，测得吸光值记为A1；用样品稀释液代替DPPH无水乙醇溶液，其余操作同上，测得吸光值记为A2。

清除DPPH自由基能力的测定[40]：取适量样液稀释1 000倍后测定。按如下公式计算样品对DPPH自由基的清除率：

清除羟自由基（·OH）活性的测定：取适量样液稀释40倍，使用羟自由基清除能力试剂盒测定其对羟自由基的清除率（具体操作及计算遵循试剂盒内说明书）。

测定清除超氧阴离子（·O2-）能力：取适量样液稀释4倍后测定，采用邻苯三酚自氧化法[41]。

总抗氧化活性的测定：取适量上述样液稀释13倍，使用总抗氧能力（T-AOC）试剂盒测定其总抗氧化能力（具体操作及计算遵循试剂盒内说明书）。

（3）数据分析

所有的统计分析和数据处理应用软件SPSS 22、TBtools JRE.1.6、Cytoscape和Origin8.0进行，每个处理重复3次，每个测定重复2次，以平均值±标准差（mean±SD）表示。

二、结果与分析

1.4种类型的紫娟绿茶主要化学成分比较

紫娟绿茶的化学成分测定结果如表1所示。可见，4种类型绿茶中的水浸出物含量为36.65%～53.28%，其中晒青绿茶的水浸出物显著高于炒青绿茶和烘青绿茶（P＜0.05）。茶多酚是茶叶生物活性的主要成分，也是衡量茶叶及制品质量的重要指标[42]，4种类型的紫娟绿茶均含有丰富的茶多酚，含量范围介于22.74%～40.15%，蒸青绿茶的茶多酚含量显著高于炒青和烘青绿茶（P＜0.05）；可溶性糖和游离氨基酸含量平均值分别为6.11%和3.30%。

4种类型绿茶中均检测到6种花青素单体（表1），单体含量趋势为Dp＞Cy＞Pg＞Pt＞Mv＞Pn，其中Cy、Pt在炒青绿茶中含量最高，在晒青绿茶中最低。花青素总量范围为2.79～3.45 mg/g，各茶类之间差异不显著（P＞0.05）。

4种类型绿茶中儿茶素总含量介于161.72～191.59 mg/g之间，EGCG是含量最高的儿茶素单体，其含量介于64.91～75.39 mg/g之间。蒸青绿茶中的EC、ECG、EGC和EGCG的含量均高于晒青、炒青、烘青绿茶。

蒸青绿茶中CA、GG、EA和My含量均显著高于晒青绿茶（P＜0.05）；Lu在炒青绿茶中最低，蒸青中最高；Kf在烘青绿茶中含量最高，炒青绿茶中最低；在4种类型绿茶中GA、Qu的含量无显著差异（P＞0.05）。总体来说，同一紫娟鲜叶原料加工的蒸青绿茶中的茶多酚、可溶性糖、咖啡碱、EA、EC、ECG、EGC和EGCG含量水平一般均高于其他3种类型的绿茶产品。

表1 4种类型紫娟茶样品生化成分含量

2.抗氧化能力的比较分析

4种类型紫娟绿茶表现出不同的抗氧化能力（图2）。结果表明，DPPH自由基的清除率范围是47.40%～94.58%，蒸青绿茶的清除率显著高于晒青、炒青和烘青绿茶（P＜0.05）；4种紫娟绿茶的羟自由基清除率范围是54.16%～57.16%，无显著差异（P＞0.05）；超氧阴离子清除率范围是32.84%～52.65%，烘青绿茶的清除率显著高于晒青、炒青、蒸青绿茶（P＜0.05）；4种紫娟绿茶总抗氧化能力范围是36.03～55.74 U/mg，蒸青绿茶总抗氧化能力显著高于炒青和烘青绿茶（P＜0.05）。

3.4种类型紫娟绿茶化学成分和抗氧化活性的相关性分析

图2 4种紫娟绿茶的抗氧化活性

对4种类型紫娟绿茶的茶多酚、花青素、黄酮类物质、可溶性糖和游离氨基酸等化学成分和茶汤清除DPPH自由基、超氧阴离子、羟自由基能力以及总抗氧化能力进行相关性分析，结果如表2。

表2 紫娟绿茶化学成分和抗氧化活性的相关性

从表2可知，Pn和Mv与总抗氧化能力负相关，茶多酚、可溶性糖与总抗氧化能力呈极显著（P＜0.01）正相关，Mv与4项抗氧化活性指标均呈负相关，游离氨基酸、Pn与DPPH清除率负相关，水浸出物、游离氨基酸和茶多酚等与羟自由基清除率正相关，游离氨基酸与超氧阴离子清除率显著正相关，而水浸出物、茶多酚与超氧阴离子清除能力呈极显著负相关。

三、讨论

紫娟品种从外形到内质都与其他大叶茶种有明显的区别，鲜嫩梢为紫色，化学成分差异较大[43]。本研究表明，紫娟茶鲜叶加工成的蒸青绿茶中茶多酚和可溶性糖含量分别为40.15%和6.33%，明显高于云南大叶种的30.00%～33.00%和1.0%～3.5%[44]，EGCG平均含量为70.30 mg/g。

王燕[45]、冯丽琴[46]等分别发现紫娟茶中花青素的浓度与其总抗氧化能力呈正相关、花青素含量与清除DPPH能力呈正相关；袁雪艳等[47]亦发现花青素浓度与抗氧化活性（清除DPPH、羟自由基和超氧自由基能力）呈线性相关。本研究中花青素除Mv和Pn外，Dp、Cy、Pt和Pg均与DPPH清除率呈正相关。闫征等[48]研究发现总酚、总黄酮等含量与抗氧化能力呈显著相关，总多酚含量越高，清除DPPH自由基能力越强[49]，多酚和儿茶素单体对DPPH和羟自由基具有很强的清除作用[46]，紫娟茶茶多酚、儿茶素含量与总抗氧化能力均呈正相关[50]。蒸青绿茶多酚含量高于其他3种类型绿茶，测定发现紫芽蒸青绿茶总抗氧化能力也高于晒青、炒青和烘青绿茶。不同的是，研究发现茶多酚含量与超氧阴离子清除率呈负相关。该结果与李翠英等[51]、陈莹[52]的研究报道类似，他们分别发现随茶多酚浓度的增加，贮藏期杏果实的超氧阴离子产生速率增加[51]，膏状或粉状茶多酚的超氧阴离子清除能力随添加量的增加而降低[52]。

四、结论

通过对4种类型紫娟绿茶的化学成分和体外抗氧化活性进行测定，结果表明，紫娟绿茶含有丰富的茶多酚、可溶性糖、花青素和儿茶素等化学成分；蒸青绿茶清除DPPH自由基和总抗氧化能力最强，烘青绿茶清除超氧阴离子能力最强。化学成分和抗氧化活性的相关性分析显示，花青素中的Pt、Pg、黄酮类中My和Qu，以及可溶性糖和没食子酸等与4项抗氧化活性均正相关，茶多酚与总抗氧化能力极显著正相关，但与超氧阴离子清除率极显著负相关。