HPLC用于蛇莓中对羟基桂皮酸的含量测定

许聪聪 林鹭 梁惠芬 安红梅 胡兵 张彤 浦益琼

[摘要] 目的 建立蛇莓药材中对羟基桂皮酸的高效液相色谱测定法。 方法 采用Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，乙腈-0.2%醋酸（14∶86）为流动相，等度洗脱，流速为1.0 mL/min，检测波长为300 nm，柱温30℃。结果 对羟基桂皮酸浓度在0.413～26.450 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性回归方程为Y=72.592X +1.1304（r = 0.9999），平均加样回收率为103.52%，RSD为2.61%。3批蛇莓中对羟基桂皮酸的含量分别为0.11、0.10、0.05 mg/g。 结论 该方法方便快速，其分离效果好，灵敏度高，重复性好，可用于蛇莓药材的质量控制。

[关键词] 蛇莓;对羟基桂皮酸;高效液相色谱法;含量测定

[中图分类号] R284.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）08（a）-0033-05

[Abstract] Objective To establish a method for the determination of p-hydroxycinnamic in Duchesnea indica （Andr.） by HPLC. Methods Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm） column was used as the column， acetonitrile-0.2% acetic acid solution （14∶86） was used as the mobile phase of the isocratic elution， with the detection wavelength of 300 nm and the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature maintained at 30℃. Results The concentration of hydroxycinnamic acid in the range of 0.413-26.450 μg/mL showed a good linear relationship with the peak area， with the equation of linear regression of Y=72.592X +1.1304 （r = 0.9999 ）. The average recovery rate was 103.52% （RSD = 2.61%）. The average content of p-hydroxycinnamic acid in 3 batches of Duchesnea indica （Andr.） determined was 0.11， 0.10 and 0.05 mg/g， respectively. Conclusion The method is convenient and rapid， and has good separation effect， high sensitivity and good repeatability. It can be used for quality control of Duchesnea indica （Andr.）.

[Key words] Duchesnea indica （Andr.） Focke; p-hydroxycinnamic; High performance liquid chromatography; Content determination

蛇莓为蔷薇科植物蛇莓Duchesnea indica（Andr.） Focke的全草，别名宝珠草、三叶莓、地莓、三点红、蛇含草、野杨梅等，为民间常用草药，在我国分布广泛[1-2]。蛇莓以全草入药，性味甘、苦、寒，入肺、肝、大肠经，具有清热解毒、散瘀消肿、收敛止血、凉血之功效，用于治疗感冒发热、咽喉肿痛、咳嗽吐血、疔疮痈肿、蛇虫咬伤、湿疹、痢疾等[3-4]。藤龙补中汤[5]是龙华医院临床验方，由藤梨根、蛇莓、龙葵、白术、茯苓、槲寄生、半枝莲等组成，可用于大肠癌、胃癌、胰腺癌等恶性肿瘤的治疗，而蛇莓是藤龙补中汤组方的君药之一。目前，相关研究[6-10]表明，蛇莓具有抗肿瘤、抑菌、增强免疫功能的效果，且对心血管、平滑肌、中枢神经系统、内分泌也有一定的作用，该中药还具有显著的抗肿瘤活性，引起国内外学者的广泛关注。

蛇莓所含化合物种类繁多，已经从中分离得到的化合物约有70多种，可大致分为6类，包括三萜类、黄酮类、鞣花酸类、香豆素类、甾醇类以及简单的有机酸[11-12]。其中，从蛇莓中分离得到的对羟基桂皮酸在中药回心草、千里光以及淡竹叶等多味中药中均有发现[13-15]。对羟基桂皮酸能刺激成骨细胞的骨形成，并通过拮抗核因子κB的活化抑制体外破骨细胞骨吸收[16];对羟基桂皮酸在体外与骨转移MDA-MB-231人乳腺癌细胞共培养的小鼠骨髓细胞中，可抑制成骨细胞矿化的抑制和破骨细胞生成的增强[17]，该成分在治疗胰腺癌、乳腺癌等癌症骨转移中發挥作用[18-19]。另外，对羟基桂皮酸通过抑制角质形成细胞活化和下调T细胞分化和细胞因子产生作用，可能对特应性皮炎具有治疗潜力[20]。因此，本研究以蛇莓中的对羟基桂皮酸为指标，建立了其快速、稳定、重现性好的测定方法，以期为蛇莓的药材质量评价研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200 series高效液相色谱仪（VWD检测器、四元恒流泵、在线脱气机、自动进样器）（美国安捷伦公司）、BS 124S万分之一电子天平（德国赛多利斯公司）、XS105DU十万分之一电子天平（梅特勒-托利多公司）、HHS型电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、SB3200超声波清洗器（宁波新芝生物科技公司）。

1.2 试药

对羟基桂皮酸（上海誉恩生物科技有限公司，批号：240072-201801，HPLC≥98%）;甲醇、乙腈为色谱纯;其他试剂均为分析纯。

蛇莓饮片购自上海康桥中药饮片有限公司和上海华宇药业有限公司，批号分别为160111（上海康桥中药饮片有限公司）、2017082803（上海华宇药业有限公司）和171202（上海康桥中药饮片有限公司），经上海中医药大学生药教研室张红梅博士鉴定为植物蛇莓Duchesnea indica（Andr.）的干燥全草。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Ultimate XB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：乙腈-0.2%醋酸溶液（14∶86），等度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长300 nm，柱温25℃，进样量10 μL。

该条件下，样品中对羟基桂皮酸色谱分离的理论塔板数>10000，分离度>1.5，对称因子为0.95～1.05，符合定量测定的色谱分离要求。见图1。

2.2 供试品溶液制备方法考察

2.2.1 提取溶剂考察  取蛇莓药材（2017082803）约2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，分别加入不同浓度的甲醇溶液（50%、70%、100%）各25 mL，称定重量，超声处理2次（功率250 W，频率50 kHz），每次30 min，滤过，合并2次滤液，水浴蒸干，再用25 mL甲醇溶解，滤过，取续滤液，即得。分别注入高效液相色谱仪中，测定蛇莓中对羟基桂皮酸的含量。提取溶剂为70%甲醇时的提取效果较为理想。见表1。

2.2.2 溶剂体积考察  取蛇莓药材（2017082803）约2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，分别加入不同体积的70%的甲醇溶液（25、50、75 mL）称定重量，超声处理2次（功率250 W，频率50 kHz），每次30 min，滤过，合并2次滤液，水浴蒸干，再用25 mL甲醇溶解，滤过，取续滤液，即得。分别注入高效液相色谱仪中，测定蛇莓中对羟基桂皮酸的含量。提取溶剂体积为50 mL的提取效果较为理想。见表2。

2.2.3 提取时间考察  取蛇莓药材（2017082803）约2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，分别加入50 mL 70%甲醇，超声处理2次（功率250 W，频率50 kHz），分别每次超声15、30、45 min，滤过，合并2次滤液，水浴蒸干，再用25 mL甲醇溶解，滤过，取续滤液，即得。分别注入高效液相色谱仪中，测定蛇莓中对羟基桂皮酸的含量。提取时间为15 min的提取效果较为理想。见表3。

2.2.4 对照品储备液制备  精密称定对羟基桂皮酸对照品5.29 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解、定容，制成0.529 mg/mL的对照品储备液。

2.2.5 供试品溶液制备  根据供试品溶液的制备方法考察结果，最终确定其制备方法为：取本品粉末（过三号筛）约2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇溶液50 mL，称定重量，超声处理2次（功率250 W，频率50 kHz），每次15 min，滤过，合并2次滤液，水浴蒸干，再用25 mL甲醇溶解，滤过，取续滤液，即得。

2.3 线性关系考察

取对羟基桂皮酸对照品储备液适量，加一定量的甲醇，制成浓度分别为0.41、0.83、1.65、3.31、6.61、13.23、26.45 μg/mL的一系列对照品溶液。分别吸取上述的对照品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定。以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），计算得到回归方程Y=72.592X +1.1304（r = 0.9999），对羟基桂皮酸浓度在0.413～26.450 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。见图2。

2.4 精密度试验

分别取浓度为0.826 563、3.306 25、13.25 μg/mL对照品溶液，精密吸取该对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪中，连续测定6次，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，RSD值分别为1.98%、1.42%、1.32%;精密吸取该对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪中，每天1针，连续测定6 d，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，RSD值分别为2.27%、3.39%、1.57%。表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

取蛇莓药材粉末约2 g，按“2.2.5”供试品溶液的制备项下方法处理，按“2.1”项下色谱条件在0、2、4、6、8、10、12、24 h进行测定，其含量分别为0.011%、0.011%、0.011%、0.011%、0.012%、0.011%、0.011%，RSD为3.90%。表明该样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验

取蛇莓药材粉末约2 g，精密称定，平行6份，按“2.2.5”供试品溶液的制备项下方法处理，按“2.1”项下色谱条件条件进行测定，其含量均值为0.011%，RSD为2.82%。表明该样品处理方法和含量测定方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

取已知含量的蛇莓药材粉末约1 g共9份，分別精密称定，再分别加入相当于样品中对羟基桂皮酸50%、100%、150%的对照品，按“2.2.5”供试品溶液的制备项下方法处理，按“2.1”项下色谱条件进行测定，平均加样回收率为103.52%，RSD值为2.61%。表明该方法测定对羟基桂皮酸的含量回收率高，准确性好。见表5。

2.8 样品测定

取3批蛇莓药材（160111、2017082803、171202）约2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇溶液50 mL，称定重量，超声处理2次（功率250 W，频率50 kHz），每次15 min，滤过，合并2次滤液，水浴蒸干，再用25 mL甲醇溶解，滤过，取续滤液，即得。分别注入高效液相色谱仪中，测定蛇莓中对羟基桂皮酸的含量。见表6。

3 讨论

本研究考察了甲醇-磷酸水以及乙腈-醋酸水等多个流动相系统，确定以乙腈-0.2%醋酸水=14∶86为流动相，在该系统下对羟基桂皮酸与蛇莓中的其他成分得到了良好分离;考察了样品提取方法，样品含有大量叶绿素，干扰测定，直接用甲醇提取，其含量较低，经系统比较后，确定了先使用70%甲醇提取、蒸干后再用甲醇复溶的样品制备方法，既提高了提取效率，又减少了杂质干扰。本研究建立了蛇莓中对羟基桂皮酸的高效液相色谱定量检测方法，该方法方便、快速、分离效果好、灵敏度高、重复性好，可用于蛇莓药材的质量控制。

藤龙补中汤[5，21-23]是龙华医院临床验方，可用于大肠癌、胃癌、胰腺癌等恶性肿瘤的治疗，尤其在晚期大肠癌的治疗方面发挥显著作用。该方宗健脾解毒组方，同时结合现代药理研究。既往研究[24-26]发现，该方可调控RKO细胞多个转移相关基因表达，促进人结肠癌RKO细胞衰老，并可抑制大肠癌肺转移。蛇莓作为君药之一，发挥了其抗肿瘤作用。

单味药蛇莓本身也具有强的抗肿瘤活性。蛇莓水提取物对小鼠移植瘤S180（多形细胞性肉瘤）、H22（肝细胞瘤）和S37（未分化小鼠肉瘤）的生长有明显的抑制作用：当口服给药剂量为10.4g生药/kg时，对S37的抑瘤率为70%;而当剂量为5.2 g/kg时，对S180和H22的抑瘤率分别为59%和31%;另外，蛇莓水提物为生药0.4 mg/mL時，对人肝癌细胞SMMC-7721、人胃癌SGC-7901和人食管癌Eca-109细胞均具有显著的杀伤作用，杀伤率高达100%[27]。此外，蛇莓水提物对鼠肺癌LLC细胞、人胰腺癌Panc02细胞和乳腺癌MC-NeuA细胞的生长亦有较好的抑制作用[28]。

目前，对中药蛇莓的研究主要集中在以下几类成分：三萜类、糖苷类、有机酸、酚类物质、黄酮类等，且大多采用先提取分离、后进行系列药理研究以确认其有效性的研究模式，并取得了一定的成效[29-30]。但是，现有研究大多为蛇莓提取物，未有具体单体成分的定量方法。蛇莓的有效部位主要在于哪类成分？能否从有效部位中分离得到有效的单体，并将其作为指标性成分？与主要药理作用的有效成分及其作用机制是什么？这些问题均不明确。在现有研究基础上，如采用气质联用法分析蛇莓中的挥发性成分（薄荷酮、百里香醌、六氢法呢基丙酮、松茸醇、伞花烃、3-甲基庚醇乙酸酯等）[31]、采用高效液相法测定其他活性成分（齐墩果酸、熊果酸、糅花酸、花色苷）的含量[32-37]，对蛇莓药材中的其他相关活性成分进行系统研究和探索，并制订量化标准，将对蛇莓的进一步质控与合理利用，乃至相关新药的研发提供参考，从而保证并优化临床用药。

[参考文献]

[1]  国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海：上海科学出版社，1999：2628.

[2]  刘湘丹，高昱，张亚利，等.随机扩增多态性DNA技术对湘产蛇莓种质资源的遗传多样性分析[J].中国药房，2015， 26（19）：2628-2631.

[3]  张帅，刘胜.中药蛇莓的药理作用和临床应用研究进展[J].云南中医中药杂志，2016，37（6）：79-81.

[4]  吴培楠，段宏泉，姚智，等.蛇莓中具有抗癌活性的三萜类成分[J].中草药，2007，38（9）：1311-1313.

[5]  胡兵，李刚，安红梅，等.藤龙补中汤联合化疗治疗晚期大肠癌临床研究[J].中华中医药学刊，2015，33（1）：37-39.

[6]  Peng B，Hu Q，Sun L，et al. Duchesnea phenolic fraction inhibits tumor growth through restoring the Th1/Th2 balance in U14 cervical cancer bearing mice [J]. Chin Med，2012，3（1）：42-45.

[7]  胡兵，沈克平，史秀峰，等.蛇莓对人结肠癌RKO细胞失巢凋亡作用的实验研究[J].世界中西医结合杂志，2013， 8（1）：69-72.

[8]  吴英俊，王超男，刘洁婷，等. 蛇莓中齐墩果酸对肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用[J].中国生化药物杂志，2011， 32（4）：306-308.

[9]  李明，赫军，马秉智，等.中药蛇莓化学成分和抗肿瘤药理作用的研究进展[J].中国医院用药评价与分析，2017， 17（5）：595-596，600.

[10]  伍世恒，龚又明.蛇莓提取物对肝癌H22小鼠的抑瘤作用及机制[J].广东医学，2016，37（9）：1300-1302.

[11]  张聪子，童巧珍.蛇莓的研究进展[J].中医药导报，2013， 19（4）：86-88.

[12]  袁蕾.植物蛇莓化学成分的研究[D].延吉：延边大学，2013.

[13]  陈泉，吴立军，王军，等.中药淡竹叶的化学成分研究[J].沈阳药科大学学报，2002，29（1）：23-24，30.

[14]  蔡鹰，赵宁志，陆瑜，等.HPLC测定回心草中对羟基桂皮酸的含量[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（17）：75-77.

[15]  谭道鹏，侴桂新，王峥涛.HPLC测定千柏鼻炎片中对羟基桂皮酸和金丝桃苷的含量[J].中国现代应用药学，2010，27（6）：532-534.

[16]  Yamaguchi M. The botanical molecule p-hydroxycinnamic acid as a new osteogenic agent：insight into the treatment of cancer bone metastases [J]. Mol Cell Biochem，2016，421（1）：193-203.

[17]  Yamaguchi M，Weitzmann MN. The bone anabolic carotenoid p-hydroxycinnamic acid promotes osteoblast mineralization and suppresses osteoclast differentiation by antagonizing NF-kappa B activation [J]. Int J Mol Med，2012， 30（3）：708-712.

[18]  Yamaguchi M，Murata T，El-Rayes BF，et al. The flavonoid p-hydroxycinnamic acid exhibits anticancer effects in human pancreatic cancer MIA PaCa-2 cells in vitro：Comparison with gemcitabine [J]. Oncol Rep，2015，34（6）：3304-3310.

[19]  Yamaguchi M，Murata T，Shoji M，et al. The flavonoid p-hydroxycinnamic acid mediates anticancer effects on MDA-MB-231 human breast cancer cells in vitro：Implications for suppression of bone metastases [J]. Int J Oncol，2015，47（4）：1563-1571.

[20]  Lee HS，Choi EJ，Lee KS，et al. Oral Administration of p-Hydroxycinnamic acid attenuates atopic dermatitis by downregulating Th1 and Th2 cytokine production and keratinocyte activation [J]. PLoS One，2016，11（3）：e0150952.

[21]  胡兵，李剛，安红梅，等.藤龙补中汤对晚期大肠癌患者Th1型免疫反应作用[J].中国中西医结合消化杂志，2014， 22（8）：434-436，439.

[22]  胡兵，安红梅，李刚，等.藤龙补中汤对晚期大肠癌患者调节性T细胞作用临床研究[J].世界中西医结合杂志，2014，9（3）：294-296.

[23]  胡兵，安红梅，李刚，等.藤龙补中汤加减对大肠癌患者免疫功能影响的临床研究[J].世界中西医结合杂志，2013， 8（2）：178-180，193.

[24]  胡兵，安红梅，郑佳露，等.藤龙补中汤对大肠癌RKO细胞转移相关基因表达影响[J].中国中西医结合消化杂志，2018，26（5）：416-419.

[25]  胡兵，安红梅，郑佳露，等.藤龙补中汤对大肠癌RKO细胞衰老及其可能的作用机制[J].肿瘤，2016，36（12）：1307-1311.

[26]  邓珊，安红梅，胡兵，等.藤龙补中汤对大肠癌肺转移及肿瘤相关巨噬细胞作用[J].中国中西医结合消化杂志，2016，24（7）：515-519.

[27]  段泾云，刘小平，李秦.蛇莓抗肿瘤作用研究[J].中药药理与临床，1998，14（3）：28.

[28]  Shoemaker M，Hamilton B，Dairkee SH，et al. In vitro anti-cancer activity of twelve Chinese medicinal herbs [J]. Phytother Res，2005，19（7）：649-651.

[29]  Zhu M，Dong X，Guo M，et al. Phenolic Profiling of Duchesnea indica Combining Macroporous Resin Chromatography （MRC） with HPLC-ESI-MS/MS and ESI-IT-MS [J]. Molecules，2015，20（12）：22463-22475.

[30]  Chen J，Sun C，Han L，et al. Extraction of crude polysaccharides from Duchesnea indica （Andrews） Focke：optimization by response surface methodology [J]. Biosci Biotech Bioch，2015，79（8）：1246-1256.

[31]  王晨旭，于兰，杨艳芹，等.多种提取方法分析蛇莓挥发性组分[J].分析化学，2014，42（11）：1710-1714.

[32]  袁晓环，王伟光，李春彦，等.HPLC法检测蛇莓中齐墩果酸的含量[J].中国生化药物杂志，2010，31（3）：195-197.

[33]  张建平，张羽飞，包海花，等.HPLC法检测蛇莓中熊果酸的含量[J].牡丹江医学院学报，2010，31（2）：25-27.

[34]  吴英俊，韩冬梅，武艳，等.高效液相色谱法同时检测蛇莓饮片齐墩果酸与熊果酸的含量[J].医药导报，2010， 29（8）：1069-1071.

[35]  童巧珍，刘义芳，李凤娟，等.湖南省不同产地蛇莓中熊果酸含量差异分析[J].中医药导报，2013，19（6）：70-71.

[36]  李玲玲，黄炎，毕志明.中药蛇莓的薄层色谱鉴别及含量测定研究[J].中国新药杂志，2014，23（18）：2203-2206.

[37]  何晨阳，刘明月，时振伟，等.响应面法优化蛇莓花色苷浸提工艺及稳定性研究[J].中草药，2018，49（8）：1829-1834.

（收稿日期：2018-01-02  本文编辑：王   蕾）