环介导等温扩增技术在鸭源成分检测中的研究

吴 潇 ，吕贝贝 ，蒋 玮 ，白 蓝 ，武国干 ，王金斌 ，，王荣谈 ，潘爱虎 ，唐雪明 *

（1.上海市农业科学院 生物技术研究所，上海 201106；2.上海市农业遗传育种重点实验室，上海 201106；3.上海瑞丰农业科技有限公司，上海 201106）

食品安全关系到老百姓的身体健康和生命安全，关系到社会的稳定。肉制品是人们日常生活中主要的动物蛋白来源，包括：鲜肉（分割肉，肉卷），腌制肉（咸肉，香肠，火腿等），另外还有酱卤肉，培根，肉干，肉脯，肉丸，调理肉串等[1-2]。由于肉制品无法具备动物整体形态的特异性，一旦经过加工工艺的处理，消费者更是难以辨认真假[3]。面对目前牛羊肉市场存在的混乱现象，根据肉的色泽，气味，纹理，肥瘦等方面进行鉴别的传统方法已不能满足职能部门监管的需求[4-6]，为了鉴别肉产品的成分，已建立了物理，化学，免疫学和分子生物学等方法[7-9]。

目前，在肉产品的成分检测中使用的有PCR方法[10-12]，光谱法[13-15]和质谱法[16]。 PCR 方法包括常规PCR 方法、多重 PCR 方法[17]、PCR-RFLP分析方法[18]、荧光定量PCR技术[19-21]和微滴数字PCR定量检测方法[19]。在现有的检测方法中，无论是PCR方法，还是光谱法和质谱法，都是离不开昂贵的实验仪器的实验室检测方法，侧重于终端产品检测，难以在现阶段我国食品安全事件多发、样本分散的情况下及时快速、全面地从源头和现场进行检测。在肉产品质量监管过程中，采集样品带回实验室进行检测费时费事，因此非常需要建立一种检测技术实现快速检测，并在现场获得检测结果。

等温扩增技术 （Isothermalamplification technology）是PCR技术的衍生技术，通过添加不同活性的酶和特异性引物，在恒温下进行反应过程，来达到快速核酸扩增的目的，环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是其中的一种[4]。LAMP技术除了高特异性、高灵敏度外，其优势在于对仪器设备要求低，置于水浴锅或恒温箱中63℃左右保温30～60 min就能完成反应，结果的检测不需要进行凝胶电泳，只需通过肉眼观察绿色荧光的生成来判断，简便快捷，非常适合现场快速可视化检测[1]，因此，LAMP技术已广泛应用于各种食源性病毒的基层检测[22-24]。目前，LAMP技术应用于动物源产品成分的现场可视化速测的研究还鲜有报道。

鉴于商贩多用鸭肉对牛、羊肉进行掺假，本研究采用环介导等温扩增技术建立了一种鸭源性成分的检测方法，旨在实现市面销售的不同类型肉产品中鸭源成分的现场快速检测，为市场监管部门提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验所用鸭肉，鸡肉，羊肉，牛肉，猪肉均购于上海市超市和农贸市场；冰冻羊肉卷，肉串，牛肉粒，牛肉干等畜肉加工食品购于上海市超市和农贸市场。DNA提取试剂盒、MgSO4、dNTPs、甜菜碱购于生工生物工程（上海）股份有限公司；苯酚、氯仿、异戊醇、乙醇购于国药集团化学试剂有限公司；Bst DNA聚合酶购于NEB公司。本实验同时采用酚氯仿抽提法和试剂盒提取样品的DNA。

1.2 LAMP引物设计

根据鸭的基因全序列 （NCBI，accession No.NW_004676510），使用 Primer5.0软件设计，经BLAST分析筛选出一对品种特异性引物。正向引物：5’-GGGGAATTTAGAGGTCAGT-3’， 反向引物：5’-GAAGCATGGAGGAAGATAG-3’。

对PCR产物进行凝胶回收用于克隆测序，用以验证扩增片段为预期产物。以此序列为模板，登陆Eiken Chemical公司的在线软件PrimerExplore（http：//www.primerexplorer.jp/e/）设计引物[15]。设计一对外引物F3和B3，一对内引物FIP和BIP及一对LF和LB引物。内引物FIP由F1c、F2（F2c的互补序列）及中间间隔区组成，BIP由B1c、B2（B2c的互补序列）及中间间隔区组成（表1）。

表1 LAMP引物的设计Table 1 Primers designed of LAMP

1.3 LAMP反应条件的优化

1.3.1 引物对LAMP反应的影响 内引物和外引物的浓度比例优化：依次按照内、外引物比例1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8 进行实验，选择最佳浓度比。

1.3.2 反应温度的优化 为了确定LAMP反应的最佳温度，用梯度PCR仪设计温度梯度为58.0～65.0℃内的12个梯度，其他反应条件不变，确定LAMP反应的最适温度。

1.3.3 MgSO4添加量的优化 本实验对MgSO4添加量进行了优化，将反应体系中的MgSO4添加量依次设为 0、0.5、1.0、1.5 和 2.0 μL，分别进行 LAMP 反应，确定MgSO4的最佳反应添加量。

1.3.4 甜菜碱添加量的优化 本实验对甜菜碱添加量进行了优化，将反应体系中甜菜碱添加量依次设为 0、1.0、2.0、3.0、4.0 和 5.0 μL， 分别进行 LAMP反应，确定甜菜碱的最佳反应添加量。

1.3.5 Bst DNA聚合酶添加量的优化 Bst DNA聚合酶的浓度为8 U/μL，本实验对Bst DNA聚合酶添加量进行了优化，将反应体系中的Bst DNA聚合酶添加量依次设为 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 和 1.2 μL，根据扩增结果确定Bst DNA聚合酶的最佳添加量。

1.3.6 反应时间的优化 将LAMP反应时间分别设定为 25、30、35、40、45、50、55 和 60 min， 根据产物亮度确定LAMP反应完成的最短时间。

1.3.7 dNTPs添加量的优化 本实验对dNTPs添加量进行了优化，将反应体系中的dNTPs添加量依次设定为 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 和 4.5μL，分别进行LAMP反应，确定dNTPs的最佳反应添加量。

1.4 LAMP引物特异性和灵敏度分析

使用设计的鸭的LAMP引物分别在羊肉，牛肉，猪肉，鸡肉和不同品种的鸭肉中进行PCR扩增，进行特异性实验。为了判断引物能否用于混合肉（市场上出售的含有鸭肉成分的牛羊肉）中鸭源成分的检测，按照一定的比例将牛羊肉的DNA和鸭肉DNA混合在一起使混合DNA中鸭DNA的含量分别是100%、50%、10%、5%、1%、0.5%和0.1%。

1.5 市场牛羊肉制品抽样调查

对市场上买回来的羊肉卷，牛肉卷和牛肉粒采用DNA提取试剂盒进行DNA提取：首先将离心管做好编号；将动物组织放入研钵，加入液氮并快速磨碎，称取磨好的组织30 mg放入已编好记号的离心管中；然后按照DNA提取试剂盒的操作说明依次进行，最后把提取的DNA冷藏备用。然后由两个实验室同时分别使用PCR特异引物（SNT3731.5—2013）和LAMP引物（表1）对每个样品的DNA进行扩增，记录LAMP检测的结果和常规PCR的结果，并进行比较。

2 结果与分析

2.1 LAMP反应的检验与验证

为了保证LAMP扩增的为目的片段，对LAMP产物进行验证。使用引物F3和B3对LAMP的产物进行重扩增，得到一条250 bp长度左右的亮带，然后割胶回收片段进行克隆测序，得到序列长度是241 bp，如图1所示。将测序得到DNA片段进行比对分析，确认LAMP反应扩增的是目的片段，没有发生非特异性扩增。

图1 重扩增获得的序列Fig.1 Sequence re-amplification

2.2 LAMP引物特异性

选择鸭肉和牛肉、猪肉、鸡肉、羊肉的DNA作为LAMP反应的模板，按照优化好的LAMP反应条件进行反应并检测结果，如图2所示。

图2 LAMP反应的特异性实验结果Fig.2 Result of specificity test of LAMP reaction

由图2可知，只有鸭肉的DNA能扩增出特异性条带，而在其他4个物种中的扩增结果为阴性，说明本研究建立的LAMP方法具有特异性。

2.3 LAMP反应条件的优化

2.3.1 引物对LAMP反应的影响 为了研究不同内外引物浓度比例对LAMP反应的影响，固定内引物的浓度改变外引物的浓度，结果如图3（a）所示。在反应体系中，当内引物与外引物的浓度比例为1∶1～1∶8时均可产生梯形条带，内引物与外引物的浓度比为1∶4和1∶5时条带最亮，为节约引物成本，故选择内引物和外引物浓度比为1∶4的反应体系。

2.3.2 反应温度的优化 根据梯度PCR仪设计温度 58.0～65.0 ℃12 个梯度分别为 58.0、58.4、58.8、59.5、60.4、61.3、61.9、62.8、63.5、64.4、64.8 和 65.0 ℃，进行LAMP反应，结果如图 3（b）所示。 由图 3（b）可见，1～12泳道均有梯形条带，说明58.0～65.0℃温度下都能进行反应，当反应温度为63.5℃时LAMP反应的条带最亮，因此确定LAMP反应的最适温度为63.5℃。

2.3.3 MgSO4添加量的优化 将反应体系中的MgSO4添加量依次设为 0、0.5、1.0、1.5 和 2.0 μL，分别进行LAMP反应，结果如图3（c）所示。由图3（c）可见，当LAMP反应体系中MgSO4添加量从0.5 μL开始出现梯形条带，MgSO4添加量为 1.0 μL时LAMP反应的条带最亮，因此确定LAMP反应的MgSO4最佳反应添加量为5 mM/μL。

2.3.4 甜菜碱添加量的优化 将反应体系中甜菜碱添加量依次设为 0、1.0、2.0、3.0、4.0 和 5.0 μL，分别进行LAMP反应，结果如图3（d）所示。由图3（d）可见，当LAMP反应体系中不添加甜菜碱时，也能扩增出梯形条带。但随着甜菜碱添加量的增加，条带不断增亮。当甜菜碱添加量为5.0 μL时，条带最亮，因此确定甜菜碱的最佳反应添加量为0.25μmol/μL。

2.3.5 Bst DNA聚合酶添加量的优化 改变反应体系中的Bst DNA聚合酶添加量分别进行LAMP反应，结果如图 3（e）所示。 由图 3（e）可见，当 LAMP反应体系中Bst DNA聚合酶添加量从0.2 μL开始出现梯形条带，当Bst DNA聚合酶添加量达到1.0μL时，梯形条带最亮。因此确定LAMP反应的Bst DNA聚合酶的最佳反应添加量为0.4 U/μL。

2.3.6 反应时间的优化 反应时间是LAMP扩增效率的一个重要因素，按照反应的时间梯度进行扩增，结果如图 3（f）所示。 由图 3（f）可见，第二泳道开始出现条带，LAMP反应的最短完成时间为30min。随着反应时间的增加，产物的亮度稍有增加，30 min即可满足检测的要求。

2.3.7 dNTPs添加量的优化 将反应体系中的dNTPs添加量依次设为 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 和 4.5 μL，分别进行 LAMP 反应，结果如图3（g）所示。 由图 3（g）可见，当 LAMP 反应体系中dNTPs添加量从0.5 μL开始出现梯形条带，dNTPs添加量为3.5 μL时条带最亮，因此确定LAMP反应的dNTPs最佳反应添加量为1.75 mM/μL。

2.4 LAMP反应灵敏度实验

用提取的牛肉、羊肉DNA溶液对鸭肉DNA进行梯度稀释，将混合DNA作为扩增模板，按照优化好的LAMP反应体系和条件进行LAMP反应。以牛肉为例，结果如图4所示。

图3 LAMP扩增条件优化Fig.3 Conditions optimized for LAMP amplification

图4 LAMP反应灵敏度实验结果Fig.4 Result of sensitivity test of LAMP reaction

以牛肉为例，由图4可见，当鸭肉DNA含量为100%～0.1%，电泳出现梯状条带，扩增产物加入SYBR Green I染料后变绿色。用核酸测定仪测得鸭肉DNA质量浓度为 130 μg/μL，鸭源 DNA为0.1%时，鸭源DNA质量浓度为13 pg/μL。说明该方法对鸭肉DNA的检测灵敏度可达到10 pg/μL左右，而且高浓度牛肉或羊肉DNA的存在对鸭肉DNA的检测灵敏度没有影响。

2.5 市场牛羊肉制品抽样调查

从上海闵行区3个超市和2个农贸市场采集了21份样品（图5），包括五香卤牛肉，盐水牛肉，肥牛，羊肉卷，羊肉串，牛肉酱和牛肉粒等。利用建立的LAMP检测方法对市售牛羊肉食品进行抽样检测，采用常规PCR技术进行验证（表2）。

图5 21份样品的LAMP检测结果Fig.5 Results of 21 samples by LAMP

表2 21份待测样品的检测结果Table 2 Text results of the 21 samples

由表2可见，牛肉的加工产品和羊肉卷检测出掺入了鸭源成分，在3种牛肉粒中检测不到牛肉成分，其中3号牛肉粒既无牛源成分也无鸭源成分；有5份样品中存在鸭源成分，分别是牛肉粒（S 5，S 10），牛肉干（S 6），牛肉酱（S 15）和羔羊肉卷（S 16）。

3 讨 论

自2000年Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了LAMP技术后，立即受到了各国学者、世界卫生组织和相关政府部门的关注。日本荣研公司完成了H1N1环介导等温扩增法检测试剂盒的研制，并通过早期快速诊断防止该病症的快速蔓延。短短几年，LAMP技术已广泛应用于各种食源性病毒[22，25]、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中[1，5]。如鸭瘟病毒（DPV）检测方法[26]、鸭 I型肝炎病毒（DHV I）LAMP可视化检测方法[23]、鸭圆环病毒（DuCV）的LAMP快速检测方法[24]，此外还用于转基因产品的检测[25]。

LAMP方法和常规PCR方法相比，LAMP反应在恒温下进行，省去了升温和降温的步骤，缩短了检测时间；LAMP方法只要有恒温加热装置即可完成扩增过程；常规核酸扩增产物需要用凝胶电泳来检测，而LAMP方法可以直接用肉眼观察，可以在现场完成高灵敏度的快速可视化检测，这是其他检测方法无法实现的。在肉产品质量监管过程中，采集样品带回实验室进行检测费时费事，如出现样品混淆，则导致无法得到准确的检测结果，因此LAMP方法更符合基层及市场快速检测的需要。

在LAMP反应体系中，多个因素会影响LAMP的检测效果。本研究对内外引物浓度比例、反应温度和时间、MgSO4、dNTPs、Bst DNA 聚合酶、 甜菜碱的添加量进行了优化。在优化后的LAMP检测体系中，鸭肉DNA的检测灵敏度可达到10 pg/μL。在混合肉的检测中，LAMP方法的检出限高于PCR和液相色谱、质谱联用[16]。在单一鸭源成分的检测中，LAMP方法的灵敏度高于PCR方法，比传统的PCR方法高4个数量级，虽低于荧光定量PCR技术的检出限1.78 pg[27-28]，但是已经完全满足实际意义上的检测需求。李向丽等[29]建立的LAMP法快速检测羊肉及其制品中的猪，鸭成分，反应时间需要60 min，灵敏度为0.5%。本研究建立的反应体系在金属模块浴中63.5℃30 min即可肉眼观察结果，并且灵敏度达0.1%。与李向丽等建立的LAMP体系相比，除了引物不同之外，本研究优化的LAMP扩增体系中内引物浓度、dNTPs添加量和Bst DNA聚合酶添加量都较高，这可能是反应时间能缩短的原因之一。

有研究者报道LAMP方法容易出现假阳性，为了验证本研究建立的鸭源成分LAMP快速检测方法的准确性，运用该方法对市售牛羊肉食品进行抽样检测。同时，根据SNT1119—2002标准，对样品进行了牛、羊成分的检测，检测结果显示两种方法的鉴定结果一致。其中3号牛肉粒LAMP方法的检测结果是既无牛源成分也无鸭源成分，常规PCR也显示该牛肉粒样品中没有牛、羊、猪、鸭源成分存在，该样品可能含有别的动物成分。在本研究中，建立的LAMP方法未出现假阳性，可能跟样本含量小有关系，今后需要进一步扩大样本含量对本研究建立的方法进行验证。

4 结 语

本研究建立的LAMP检测体系可以用于不同类型肉产品中鸭源成分的现场快速检测。对单一鸭肉DNA的检测限达到10 pg/μL，对牛羊肉中混入鸭源成分比例的的检测灵敏度为0.1%。