绿原酸和三羟基黄酮对奇异变形杆菌抑菌效果研究

梁 杰，吴慧敏

（1.张家口市宣化区动物卫生监督所，河北 张家口 075000；2.河北农业大学动物科技学院，河北 保定 071001）

抗生素是一种以低浓度影响其他生物各项性能的化学物质，是细菌或其他微生物的代谢产物，也可人工合成。抗生素能够抑制细菌生长并杀死细菌，因此被广泛应用于各方面。在饲料中添加抗生素可以抑制肠道内病原体的繁殖生长，也可以预防和减少疾病的发生[1]。但过多添加抗生素会让细菌产生抗性。现如今，滥用抗生素的问题已经严重影响并制约畜牧行业的发展。畜禽对疾病的抵抗力大幅降低，致病菌的耐药性则不断增强，如果疾病复发只能使用级别更高、更大剂量的抗生素，如此形成恶性循环，对畜禽的健康以及畜舍周围的环境造成恶劣的影响。而奇异变形杆菌是人兽共患的病原体，近几年来临床上出现许多耐药菌株并且其耐药性也逐渐增加，使临床治疗的任务变的更加艰巨[2]。由于国内与国际上对于添加抗生素的要求愈发严格及大众认识的日益提高，使得抗生素替代品的研究与开发越来越受到科研人员的重视。研究表明，许多中草药提取物对抑制奇异变形杆菌生长都有较好的效果[3]。

绿原酸是一种缩酚酸，由奎尼酸与咖啡酸形成，是植物体有氧呼吸的天然产物，具有生物活性[4-5]。其在高等双子叶植物和蕨类植物中普遍存在，尤其是金银花、杜仲等中草药中含量较高。在对原材料不造成有害作用的情况下，对多种腐败菌都有一定的抑制效果，除此之外还有抗病毒、抗氧化等重要作用[6]。这让绿原酸成为了备受关注的防腐添加剂的替代品。

三羟基黄酮是传统中药黄芩的主要成分，主要存在于唇形科植物黄芩的根、紫葳科植物木蝴蝶的种子、茎皮中[7]。近十几年来，许多研究和文献都说明三羟基黄酮具有显著的抑菌效果，以及抗氧化、抗辐射等多种作用，同时可以调节某些疾病，使得黄酮类化合物越来越受到学者们的青睐，被认为是抗生素替代品的最佳候选者之一。

关于三羟基黄酮和绿原酸在动物饲料添加方面的研究很少，因此，本试验研究绿原酸和三羟基黄酮的抑菌效果和最佳的抑菌浓度，筛选合适的抗生素替代品。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 试验菌种

奇异变形杆菌（CMCCB 49005）冻干菌粉，购于北纳微生物细胞管理中心。

1.1.2 试验材料

绿原酸、三羟基黄铜：市售。

1.1.3 主要仪器设备

水浴恒温振荡器（DSHG-300A）；可见分光光度计（722 型）；电热鼓风干燥箱（GZX-9240MBE）；生化培养箱（SPX-250B-Z 型）；洁净工作台（SWCJ-1B）；螺旋振荡器（QL-861）；立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-50KBS）；酶标仪（ELx800）；分析天平（BS210S）；数显游标卡尺；玻璃培养皿；微波炉；冰箱；96孔板。

1.2 试验方法

1.2.1 试验准备

在使用洁净工作台时提前开启紫外灯30 min进行灭菌，进入工作台前需戴一次性口罩和一次性手套，进入后使用75%酒精棉球进行手部消毒。试验材料需进行高压灭菌后使用。为尽量减少试验的误差，所有操作均在工作台中完成。

1.2.2 平板培养基及斜面培养基的制备

平板培养基：待上述配置好且已经过灭菌后的固体培养基冷却至50～60 ℃后，在洁净操作台中分别倒入一次性培养皿中，15～20 mL 即可，然后水平放置。

斜面培养基：将上述备用的培养基分别倒入试管中，塞入松紧适宜的棉塞。试管规格为15×150 mm，其容量为5 mL，倒入培养基的体积约为试管的1/4。将分装好的试管进行灭菌，结束后等温度降至50 ℃时取出。将试管顶端置于高度为1 cm 的物体上，试管内的液体会自然倾斜，凝固之后就制成斜面培养基，低温保存备用。

1.2.3 菌种的活化

在洁净工作台中，使用75%酒精棉球对冻干菌种管外壁进行擦洗消毒，稍干。使用酒精灯将菌种管的上端加热，用滴管吸取少许液体培养基，滴到菌种管上端加热处，使得管壁淬火而破裂。在冻干管中加入液体培养基0.5 mL，用移液枪吹吸混匀后全部吸出再注入到液体培养基，摇匀。分别吸取菌混悬液200 μL 于两平板培养基表面，均匀涂至有阻力感即可。将平板放入培养箱中培养24 h，温度设为37 ℃。

1.2.4 菌种的传代

采用划线法把初次活化后的菌种通过接种环接种到平板上，倒置放于37 ℃培养箱中培养24 h，连续培养2～3 代。选择培养基上长势较好的菌落，接种在斜面上，低温保存。

1.2.5 混悬液的制备

菌种活化后，用接种环挑取适量菌种于200 mL液体培养基中，在120 r·min-1，37 ℃条件下放入水浴恒温振荡器中培养约3 h。制成600 nm处OD值是0.1～0.2，浓度约为105cfu·mL-1的菌混悬液备用。

1.2.6 供液试液的配置

营养琼脂固体培养基（NA）：准确称取固体培养基9.9 g 置于锥形瓶中，倒入蒸馏水300 mL，搅拌至固体溶解后，使用微波炉加热，煮沸，然后放入121 ℃的灭菌锅内进行灭菌，20 min 后取出备用。

营养肉汤液体培养基（NB）：准确称取液体培养基5.4 g 于锥形瓶，倒入300 mL 蒸馏水，搅拌且完全溶解后开始灭菌，步骤同上。

称取三羟基黄酮、绿原酸各4 g，分别溶于乙醇、丙酮中，得到200 mg·mL-1的药液，再用相应的溶剂对上述溶液按一定梯度进行稀释，每种药液得到100、50、10、5、1、0.5 和0.1 mg·mL-17个浓度梯度的供试药液。空白对照为各自相应的溶剂。

1.2.7 抑菌活性的测定

待已灭菌的NA培养基温度降至约50 ℃，加入体积与1%的培养基相同的试验菌，充分混匀，40 ℃时倒入玻璃培养皿内，每皿约30 mL，放入冰箱4 ℃保藏1 h，待其凝固，得到指示菌培养平板。凝固后，用镊子夹取已灭过菌的牛津杯，在酒精灯上加热至微热后，垂直放置在制备好的平板上，每个平板放3个即可。等待5～10 min，使牛津杯冷却，依次在牛津杯中加入不同浓度的药液40 μL。每个浓度分别做3 个重复，在恒温培养箱中37 ℃条件下培养18 h，有明显抑菌圈的测量其大小，并计算直径的平均值。直径越大表明药液对细菌的抑制效果越好。

1.2.8 最低抑菌浓度的测定（微量肉汤稀释法）

向96孔板的各个孔中加入NB液体培养基（第1孔160 μL，第11 孔100 μL，其余各孔为90 μL），使用微量肉汤稀释法，在第1 孔至第10 孔加入已配制好的供试药液，11、12 孔不加药液作为空白对照（配制药液浓度为5 mg·mL-1，用移液枪吸取40 μL药液加入第1孔中，吹吸混匀，再吸出90 μL加入第2孔中。按同样的方法，依次在前1个孔混匀后，吸取90 μL 加到后1 个孔中，直到第10 孔。在第1孔和第10孔混匀后，分别吸取20和90 μL丢弃，使各孔体积分别为90 μL）。而后，在第1～10孔及12 孔中加入浓度为106cfu·mL-1的奇异变形杆菌菌液，第11 孔中不加，此时每个孔中的菌的浓度为105cfu·mL-1。每种药物设3 个重复，并做一组避免药物颜色干扰的对照，方法同前几组相同，只是用生理盐水代替菌液，以保证体积相同。各孔加好后体积均为100 μL，随后将96 孔板放入恒温培养箱，37 ℃条件下培养22 h。然后，用酶标仪测定各孔的OD值，波长设定为630 nm，与对照组进行比较，计算在不同的浓度下细菌生长的百分数，再换算为细菌生长的抑制率，当细菌生长的百分数＜20%时，此浓度即为药液的最低抑菌浓度。细菌生长百分数和细菌生长抑制率计算公式见式1～2。

细菌生长百分数=（某浓度含药孔吸光度的OD值-药物颜色对照孔OD 值的平均值-无菌孔OD 值的平均值）/（无药细菌生长对照孔OD 值的平均值-无菌孔OD值的平均值） （1）

细菌生长抑制率=1-细菌生长百分数 （2）

2 试验结果

2.1 三羟基黄酮对奇异变形杆菌的抑菌效果

三羟基黄酮对奇异变形杆菌的抑菌效果见表1。

表1 三羟基黄酮对奇异变形杆菌的抑菌效果

由表1可知，三羟基黄酮对奇异变形杆菌的抑制效果在试验浓度200 mg·mL-1时达到最佳，抑菌圈的直径约23.53 mm，在试验浓度为0.1 mg·mL-1时效果最弱，抑菌圈直径约13.36 mm。在浓度为200、100、50 以及20 mg·mL-1时，抑菌圈直径均＞20 mm，属极度敏感；浓度为10、5 mg·mL-1时，抑菌圈直径＞15 mm，属高度敏感；浓度为0.5、0.1 mg·mL-1时，抑菌圈直径＞10 mm，属中度敏感。

2.2 绿原酸对奇异变形杆菌的抑菌效果

绿原酸对奇异变形杆菌的抑菌效果见表2。

表2 绿原酸对奇异变形杆菌的抑菌效果

由表2可知，绿原酸对奇异变形杆菌生长的抑制效果随着试验浓度增加而加强，到200 mg·mL-1时抑菌圈的直径为16.74 mm。在浓度为200、100、50 mg·mL-1时，抑菌圈直径均＞15 mm，属高度敏感；其余浓度抑菌圈的直径均＞10 mm，属中度敏感。

2.3 两种药液对奇异变形杆菌的最低抑菌浓度

绿原酸溶液和三羟基黄酮溶液对奇异变形杆菌的MIC的测定见表3～4。

表3 绿原酸溶液对奇异变形杆菌的MIC的测定

表4 三羟基黄酮溶液对奇异变形杆菌的MIC的测定

由表3 和表4 可知，绿原酸对奇异变形杆菌最低的抑菌浓度为0.2 mg·mL-1，三羟基黄酮对奇异变形杆菌最低的抑菌浓度为0.125 mg·mL-1。

3 讨 论

研究表明，绿原酸是具有生物抑菌作用的天然防腐剂，也是一些传统中药的有效抗菌成分之一。周志娥等认为，绿原酸的分子极性较强，对大分子物质的亲和力较高，可结合于细菌膜表面并使其结构发生改变，增大细胞膜的选择透过性，破坏细胞完整性，导致细菌体内核苷酸、酶等物质部分外泄，从而影响蛋白质的合成[8]。陈明光等研究认为金银花的主要成分为绿原酸[9]。谢新芳等利用金银花不同溶剂提取物对奇异变形杆菌做了抑菌实验，乙醇提取物的最低抑菌浓度为15.6 mg·mL-1，药液浓度为62.5 mg·mL-1时抑菌圈直径＞20 mm，水提取物的最低抑菌浓度为31.25 mg·mL-1，药液浓度在31.3 mg·mL-1出现抑菌圈[10]。上述研究结果均表明，绿原酸对奇异变形杆菌具有抑制作用。本试验中最低抑菌浓度为0.2 mg·mL-1，药液浓度在0.1 mg·mL-1时有抑菌效果，与上述文献的研究结论一致，但数据相差较大，原因可能为本试验所用绿原酸纯度为45%，不含其他物质，而谢新芳等用的是提取液，可能含有其他抑菌类物质。

三羟基黄酮作为黄芩的重要组成成分之一，抑菌活性良好。许云华等认为，三羟基黄酮的抑菌机理主要由其化学结构决定，黄酮芳环上羟基的位置和个数影响了三羟基黄酮的抑菌活性[11]。黄芩作为抗菌药物应用范围较广，且对部分病毒有防治作用。张洺嘉等研究结果证明，黄芩素对细胞膜的形成具有较强的抑制作用[12]。Basile 等研究结果显示，黄酮类化合物对奇异变形杆菌最低的抑菌浓度是0.016 mg·mL-1[13]。赵香汝等采用纸片扩散法测定了多种中药对奇异变形杆菌及其他细菌的抑制效果，其中黄芩对奇异变形杆菌的抑菌圈为8 mm，最低抑菌浓度为7.8 mg·mL-1[14]。而本研究结果显示，药液浓度为0.1 mg·mL-1时有抑菌效果，抑菌圈的直径为13.36 mm，最低抑菌浓度为0.125 mg·mL-1，与上述文献的研究结果相似。

4 结 论

绿原酸对奇异变形杆菌有较好的抑菌效果。在本试验浓度梯度中，浓度为200 mg·mL-1时效果最好，抑菌圈的直径为16.74 mm，并且最低抑菌浓度为0.2 mg·mL-1。三羟基黄酮对奇异变形杆菌有较好的抑菌效果。在本试验浓度梯度中，浓度为200 mg·mL-1时效果最好，抑菌圈的直径为23.53 mm，并且最低抑菌浓度为0.125 mg·mL-1。