色素关键基因在山羊皮肤和B16-F10细胞增殖、分化阶段的表达及相关性研究

蒋 婧，任航行，李 杰，王高富，陈灿灿，付 琳，张 丽，刘良佳，周 鹏*

(1．重庆市畜牧科学院，重庆 荣昌 402460；2．重庆市山羊工程技术研究中心，重庆 荣昌 402460；3.甘肃农业大学动物科技学院，甘肃 兰州 730070)

【研究意义】酉州乌羊目前仅分布于重庆市酉阳县，被当地人称为“药羊”，是重庆市特有的优良遗传资源。该羊体格中小，除背脊线和两眼圈为黑毛外，其余被毛均为白色，全身皮肤及眼、鼻、口、肛门、阴门等可视黏膜为乌色。项目组前期研究发现，100日龄酉州乌羊胎儿表皮和真皮组织中已含有较多黑色素颗粒，而同日龄渝东白山羊胎儿皮肤组织中则未检测到，表明黑色素沉积是影响乌皮羊和非乌皮羊之间皮肤颜色差异的重要因素，而且在皮肤发育分化的早期，两种羊黑色素细胞的迁移就可能存在差异[1]。皮肤表皮层的黑色素细胞，是由成黑素细胞分化而来，成黑素细胞则起源于神经外胚层的神经嵴细胞沿背侧途径迁移衍生[2]。黑色素由黑色素细胞内的黑色素小体产生，其形成受多条信号通路调控，在整个黑色素生成调控网络中，包含很多重要的调控基因，其中ASIP、END3和PAX3等基因位于调控网络的上游，对位于调控网络下游的酪氨酸酶家族基因(TYR、TYR1和DCT)具有一定的调控作用[3-4]。【前人研究进展】ASIP通过抑制下游基因的表达水平或酶活性来抑制黑色素的生成，过表达ASIP可抑制真黑色素的减少而产生褐黑色素[5-6]。PAX3被认为在早期的神经嵴和黑色素细胞的发育分化中扮演重要角色，可通过激活下游基因来调控黑色素细胞的存活、增殖、迁移和分化，此外还参与了色素合成的代谢过程[7-8]。END3能有效促进成黑素细胞和黑色素细胞的存活、增殖、分化，以及调节黑色素细胞的色素合成[4,9]。TYR是黑色素合成过程中的限速酶，其活性的高低直接影响真黑色素和褐黑色素的生成[10]，TYRP1和DCT(TYRP2)属于TYR家族的成员，直接参与真黑色素合成[3,11]，它们的活性和表达受上游基因的调控。【本研究切入点】目前，这6个与黑色素合成相关的重要基因是否在不同肤色山羊皮肤中存在表达差异、是否与山羊皮肤黑色素沉积有关尚不清楚。因此，本研究拟以酉州乌羊(白毛乌皮)、板角山羊(白毛白皮)和小鼠皮肤黑色素瘤细胞(B16-F10)为研究对象，检测ASIP、EDN3、PAX3、TYR、TYRP1和DCT在成年乌皮与白皮羊皮肤组织、B16-F10增殖与分化阶段的mRNA相对表达量，分别从体内和体外检测这6个基因的表达情况，并进一步分析它们表达之间的相关性。【拟解决的关键问题】为进一步阐明山羊皮肤黑色素沉积的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

成年酉州乌羊和板角山羊公羊(各3只)由重庆市酉州乌羊资源保护场提供，屠宰后采集皮肤组织，置于液氮罐带回实验室，-80 ℃保存备用。B16-F10细胞购自中国科学院上海细胞库。

1.2 主要试剂

DMEM培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、马血清(horse serum，HS)、青链霉素和0.25 %胰酶均购自美国Gibco公司。Transcriptor First Strand cDNA Synthesis和FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)均购自德国Roche公司。Trizol试剂购自美国Invitrogen公司。

1.3 B16-F10细胞培养

B16-F10细胞增殖培养：将液氮保存的B16-F10复苏于10 cm细胞培养皿中，当细胞融合度达到90 %时进行传代。吸弃培养基，PBS洗3遍；0.25 %胰酶消化，当细胞出现回缩、脱落时，10 % FBS的DMEM培养基终止胰酶消化；1000 r/min，离心2 min，弃上清，加入10 mL含10 % FBS的DMEM完全培养基，吹打均匀；接种到6孔板中，于37 ℃，5 % CO2培养箱中继续培养，隔天更换一次培养基，分别于接种后1、3、5和7 d收集细胞。

B16细胞分化培养步骤：培养于在6孔板的B16细胞当细胞融合度约80 %左右时更换为含2 %马血清的DMEM培养基进行诱导分化，隔天更换一次培养基。分别在分化后1、3、5和7 d收集细胞。

1.4 总RNA提取和cDNA合成

用Trizol法提取酉州乌羊和板角山羊皮肤组织、B16-F10细胞增殖与分化阶段细胞的总RNA，1 %琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量，核酸蛋白仪测量总RNA浓度。cDNA合成按照反转录试剂盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis)说明书进行。

1.5 实时荧光定量PCR检测各基因mRNA表达

采用实时荧光定量PCR的方法，检测ASIP、EDN3、PAX3、TYR、TYRP1和DCT基因在不同肤色山羊皮肤组织和B16-F10细胞增殖与分化阶段的mRNA表达情况。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，退火温度退火60 s，40个循环；每个基因重复3次。β-actin为内参基因，引物信息见表1。相对表达量的结果采用2-△△Ct法进行计算。

1.6 数据处理

应用IBM SPSS Statistics 22统计软件进行分析，组间方差分析和显著性检验利用独立样本t检验进行比较；各基因表达的相关性利用双变量Pearson检验。试验数据以“平均值±标准差”表示，**表示差异(或相关性)极显著(P<0.01)，*表示差异(或相关性)显著(P<0.05)。

表1 基因引物参数

2 结果与分析

2.1 酉州乌羊与板角山羊皮肤黑色素合成相关基因的表达及相关性分析

qRT-PCR检测了ASIP、EDN3、PAX3、TYR、TYRP1和DCT基因在不同肤色山羊皮肤中的mRNA相对表达量，结果(图1)显示，ASIP在酉州乌羊皮肤中的表达极显著低于板角山羊(P<0.01)，TYRP1和DCT在酉州乌羊皮肤中的表达极显著高于板角山羊(P<0.01)，PAX3、TYR在酉州乌羊皮肤中的表达显著高于板角山羊(P<0.05)，EDN3在酉州乌羊皮肤中的表达略高于板角山羊，差异不显著(P>0.05)。

如表2所示，ASIP与TYRP1和DCT呈极显著的负相关(P<0.01)。EDN3与ASIP、PAX3、TYR、TYRP1和DCT相关性均不显著(P>0.05)。PAX3与TYR和TYRP1呈极显著正相关(P<0.01)。TYRP1、TYR、DCT两两之间呈极显著正相关(P<0.01)。

2.2 黑色素合成相关基因在B16-F10细胞增殖阶段的动态表达及相关性分析

如图2所示，ASIP、TYRP1和DCT表达均呈先上升后下降的趋势，均在3 d极显著高于1 d(P<0.01)；EDN3表达与ASIP和TYRP1相似，在7 d极显著低于1 d(P<0.01)；PAX3与TYR表达模式相似，均在增殖阶段后期高于前期，且在7 d极显著高于1 d(P<0.01)。暗示它们在色素细胞增殖过程中发挥不同的调节作用。

**表示差异极显著(P<0.01)，*表示差异显著(P<0.05)** indicates the extremely significant difference (P<0.01), and * indicates significant difference (P<0.05)

各基因在B16-F10细胞增殖阶段表达的相关性(表3)显示，ASIP与TYRP1和DCT均呈极显著的正相关(P<0.01)，与PAX3呈极显著负相关(P<0.01)，与EDN3呈显著正相关(P<0.05)；PAX3与TYRP1呈极显著负相关(P<0.01)，与TYR呈极显著正相关(P<0.01)；TYRP1和DCT呈极显著的正相关(P<0.01)；其它各基因间相互不显著相关(P>0.05)。

表2 各基因在不同肤色山羊皮肤组织中的表达的相关系数

注：**表示2个基因表达呈极显著相关(P<0.01)，*表示2个基因表达呈显著相关(P<0.05)。

Note: ** indicates the extremely significant correlation between two genes (P<0.01), and * indicates significant correlation between two genes (P<0.05).

A～F分别表示ASIP、EDN3、PAX3、TYR、TYRP1、DCT在B16-F10细胞增殖阶段的mRNA相对表达量；与1 d相比，**表示差异极显著(P<0.01)，*表示差异显著(P<0.05)A-F indicated mRNA relative expression levels of ASIP, EDN3, PAX3, TYR, TYRP1 and DCT in the proliferation phase of B16-F10 cells; ** indicates the extremely significant difference (P<0.01), and * indicates significant difference (P<0.05), compared with 1 day

2.3 各基因在B16-F10细胞分化阶段的动态表达及相关性分析

各基因在B16-F10细胞分化阶段的mRNA表达情况如图3所示，ASIP与TYR和DCT具有相似的表达模式，均在3 d的相对表达量最高，其中TYR在3 d的相对表达量显著高于1 d(P<0.05)，DCT则在后面3 d的相对表达量均极显著高于1 d(P<0.01)，而ASIP在7 d的相对表达量显著低于1 d(P<0.05)；PAX3和TYRP1表达在整个分化阶段呈持续下降趋势，均在5和7 d极显著低于1 d(P<0.01)。

各基因在B16-F10细胞分化阶段表达的相关性(表4)显示，ASIP与TYRP1均呈极显著的正相关(P<0.01)，与TYR和DCT呈显著正相关(P<0.05)；PAX3与TYRP1呈极显著正相关(P<0.01)，与DCT呈极显著负相关(P<0.01)；TYR与DCT呈极显著的正相关(P<0.01)，与TYRP1呈显著正相关(P<0.05)；其它各基因间相互不显著相关(P>0.05)。

3 讨 论

动物毛色、肤色的形成主要取决于黑色素细胞中合成的真黑色素与褐黑色素的比例，真黑色素比例偏高时，表现出黑色或褐色，相反则表现出白色、黄色或红棕色[12]。TYR正是控制这2种色素合成比例的限速酶，当其活性高时，真黑色素合成比例偏高，反之褐黑色素偏高[12-13]。TYRP1和DCT有很高的同源性，促使真黑色素生成并使TYR的活性保持稳定[14]。本研究检测到TYR在酉州乌羊皮肤中的表达显著高于板角山羊，TYRP1和DCT在酉州乌羊皮肤组织中的表达极显著高于板角山羊，说明TYR、TYRP1和DCT的高表达对酉州乌羊皮肤真黑色素沉积有促进作用，前人在深色被毛和浅色被毛动物上的研究也得到类似的结果[15-18]。国内外学者研究发现，ASIP基因在深色被毛个体中表达量低于白色被毛个体[19-20]，并推测是由于ASIP抑制TYRP1和DCT基因的表达和翻译，显著降低TYR的酶活性造成的。本研究发现成年酉州乌羊皮肤组织中的ASIP基因极显著低于板角山羊，且与TYRP1和DCTmRNA表达呈极显著负相关，与前人研究结果相符，说明ASIP可能通过间接调控TYRP1和DCTmRNA表达水平来抑制酉州乌羊皮肤的真黑色素沉积。此外，本研究还发现，PAX3在酉州乌羊皮肤中表达显著高于板角山羊，与TYR和TYRP1的mRNA表达极显著正相关，暗示PAX3高表达与酉州乌羊皮肤真黑色素沉积表型密切相关。

表3 各基因在B16-F10细胞增殖阶段表达的相关系数

注：**表示2个基因mRNA表达呈极显著相关(P<0.01)，*表示2个基因mRNA表达呈显著相关(P<0.05)。

Note: ** indicates the extremely significant correlation between mRNA expression of two genes (P<0.01), and * indicates significant correlation between mRNA expression of two genes (P<0.05).

A～F分别表示ASIP、EDN3、PAX3、TYR、TYRP1、DCT在B16-F10细胞分化阶段的mRNA相对表达量；与1 d相比，**表示差异极显著(P<0.01)，*表示差异显著(P<0.05)A-F indicated mRNA relative expression levels of ASIP, EDN3, PAX3, TYR, TYRP1 and DCT in the differentiation phase of B16-F10 cells; ** indicate the extremely significant difference (P<0.01), and * indicates significant difference (P<0.05), compared with 1 day

表4 各基因在B16-F10细胞分化阶段mRNA表达的相关系数r

注：**表示两个基因表达呈极显著相关(P<0.01)，*表示两个基因表达呈显著相关(P<0.05)。

Note: ** indicates the extremely significant correlation between two genes (P<0.01), and * indicates significant correlation between two genes (P<0.05).

酪氨酸酶基因家族(TYR)包括TYR与TYRP1、DCT3个基因，其中TYRP1、DCT基因均来源于TYR基因的自我复制和变异，虽然它们的外显子个数不一样，但它们编码的蛋白质一级结构相似，且均在黑色素生成过程中发挥重要作用[11, 21]。黑素小体是生成黑色素的细胞器，在其发育前期，黑色素还未生成时，TYR酶活性较高，随着黑色素的慢慢沉积，TYR酶活性逐渐降低，当黑素小体完全充满了黑色素时，TYR酶活性也完全失去[22]。本研究在B16-F10细胞增殖阶段，检测到TYRmRNA表达随着增殖时间的增加而增加，在细胞分化前期，TYRmRNA表达呈上升趋势，到分化3 d，其相对表达量达到最高，随后下降，在分化7 d达到一个较低值。说明B16-F10细胞在增殖阶段，只是细胞数量上在发生变化，而未生成黑色素；在分化阶段前期，大量黑素小体处于发育前期，到分化阶段后期，随着黑色素颗粒的增多，越来越多的黑素小体进入发育后期，TYR的表达及活性也随之降低。TYRP1和DCT分别与TYRmRNA表达在B16-F10细胞分化阶段呈显著和极显著正相关，但在增殖阶段相关性不显著，说明TYRP1和DCT只在黑色素生成过程中对维持TYR活性的稳定具有一定的功能，这与TYRP1和DCT只参与真黑色素生物合成的理论相符。本研究检测到PAX3表达在B10-F10细胞增殖阶段后期极显著高于前期，说明PAX3确实在早期黑色素细胞发育中扮演重要的角色。而随着B10-F10细胞诱导分化时间的增加，PAX3基因表达呈持续降低的趋势，说明PAX3参与了色素合成的代谢过程，且与前人认为PAX3表达显著下调是B16细胞分化并产生黑色素的重要前提条件相符[1]。

综上所述，TYR直接参与山羊皮肤和B16-F10细胞真黑色素的合成过程，其高表达能促进真黑色素的生成，影响酉州乌羊皮肤黑色素沉积。TYRP1和DCT只在真黑色素合成过程对维持TYR表达有作用，从而间接对酉州乌羊皮肤黑色素沉积具有促进作用。ASIP对TYRP1和DCT表达具有负调控作用，低表达ASIP促进了酉州乌羊皮肤黑色素的沉积。PAX3表达显著下调是黑色素瘤细胞分化并产生黑色素重要前提条件，但其高表达能促进黑色素细胞的发育与增殖，所以在酉州乌羊皮肤中，PAX3可能通过促进黑色素细胞数量的增多来促进黑色素的沉积。本研究结果还暗示，EDN3可能不是导致板角山羊与酉州乌羊皮肤黑色素沉积差异的关键基因。这些研究结果为将来进一步阐明酉州乌羊皮肤黑色素沉积的分子机制提供基础资料。但黑色素生成过程太过复杂，现在的研究还只是冰山一角，是否还存在其他通路的调控尚未清楚，且每个基因是否还参与调控其他性状的信号通路也不清楚，有待进一步研究。

4 结 论

TYR、TYRP1和DCT基因高表达能促进真黑色素的生成，影响酉州乌羊皮肤黑色素沉积。PAX3可能通过促进黑色素细胞数量的增多来促进皮肤黑色素的沉积。ASIP对TYRP1和DCT表达具有负调控作用，低表达ASIP促进了酉州乌羊皮肤黑色素的沉积。EDN3可能不是导致板角山羊与酉州乌羊皮肤黑色素沉积差异的关键基因。