槐角中还原糖的含量测定

牛晓静，陈天朝，鲁静，施钧瀚，马彦江

(河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450008)

还原糖是指具有还原性的糖类。在糖类中，分子中含有游离醛基或酮基的单糖和含有游离醛基的二糖都具有还原性。还原性糖包括葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖和麦芽糖等。关于还原糖的含量测定方法有3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)[1-2]、碱性酒石酸铜滴定法[3]、硫酸蒽酮法[4-5]和萨氏法[6]等；其中，DNS法操作简便、快捷，杂质干扰较少，适合批量测定，是目前实验室测定还原糖最常用的方法。虽然目前有不少采用 DNS 法测定还原糖的研究，但是不同测量对象其测定条件也存在一定差异。有报道称槐角中含有葡萄糖、果糖等还原糖[7]，而未见关于槐角中还原糖的含量测定方法。因此，本研究采用DNS法，通过对影响其测定结果最关键的因素，如检测波长、DNS 用量和显色时间等进行探讨，建立槐角中还原糖含量测定方法，并进行方法学考察，为槐角中还原糖的进一步研究提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Thermo Evolution 201紫外分光光度计(赛默飞世尔科技公司)；CP225D分析天平(德国赛多利斯集团)；sartorius BSA224s-CW分析天平(德国赛多利斯集团)；HH-S4型电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)。

1.2 材料

槐角(批号：150417；产地：山东)，经河南中医药大学第一附属医院陈天朝主任药师鉴定为豆科植物槐(SophorajaponicaL .)的干燥成熟果实；D-无水葡萄糖对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110833-200503，含量以99.5%计)；3，5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钠钾、结晶酚和亚硫酸钠等均为市售分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取D-无水葡萄糖对照品，加水定容，配制成浓度为11.4 mg/mL的对照品储备液。精密吸取对照品储备液1.0 mL置10 mL量瓶中，加水稀释，定容至刻度，即得对照品溶液，浓度为1.14 mg/mL。

2.1.2 供试品溶液的制备

取槐角样品2 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入50 mL水置50 ℃水浴中浸提2次，每次2 h，合并滤液，定容至100 mL量瓶中，即得供试品溶液，备用。

2.1.3 DNS试液的配制

称取6.3 g 3，5-二硝基水杨酸(DNS) 溶于少量蒸馏水中，加入2 mol/L氢氧化钠溶液262 mL，再加入185 g酒石酸钠钾、5 g结晶酚、5 g亚硫酸钠，摇匀，冷却后定容至1 000 mL棕色容量瓶中，于4 ℃冰箱中放置7天。

2.2 还原糖测定标准曲线的绘制

精密量取无水葡萄糖对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于6个20 mL具塞试管中，补充蒸馏水至2 mL，混匀，加入1.5 mL DNS试液，摇匀后置沸水浴保持5 min，取出后以流水冷却至室温，定容至刻度，摇匀，即得。同时，以水为空白管对照，采用分光光度计测定(540±2)nm波长处的吸光度。以吸光度(Y)为纵坐标，葡萄糖浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线，得到的标准曲线为Y=0.857 1X-0.081(r=0.999 8)，在0.228～1.368 mg范围内线性关系良好。

2.3 槐角中还原糖的测定

取供试品溶液1.0 mL置20 mL具塞试管中，照上述方法，自“补充蒸馏水至 2 mL……”，测定。根据标准曲线，计算供试品中还原糖的含量。

2.4 显色条件的优化

2.4.1 测定波长的确定

文献[1-2,8]中关于还原糖的测定方法采用的波长有 540、530、520、490 nm等，为此，笔者进行了相关因素的分析。精密吸取对照品溶液、供试品和蒸馏水各1.0 mL，分别加入到20 mL具塞试管中，自“补充蒸馏水至2 mL……”，测定。再将对照品显色液-水(空白)、DNS试液-蒸馏水(空白)、对照品显色液-DNS(空白)、供试品显色液-DNS(空白)试剂分别在波长为480～600 nm范围内进行扫描。结果见图1。

从图1中可以看出，以DNS试液为空白时，对照品溶液与供试品溶液的最大吸收波长分别为520 nm和489 nm。但以水为空白时，DNS试液在此处也有较强的吸收；且样品显色消耗了部分DNS试液，造成空白对照中实际DNS含量多于样品显色液，使得样品在520 nm和489 nm处的测定均干扰严重。从曲线1可以看出，在λ=540 nm时，曲线2和4基本重合，曲线3和5基本重合，DNS试液的干扰较小。故选择最佳测定波长为(540±2)nm。

注：1:DNS试液-水(空白);2:供试品显色液-水(空白);3:对照品显色液-水(空白);4:供试品显色液-DNS试液(空白);5:对照品显色液-DNS试液(空白)。图1 测定波长选择光谱图

2.4.2 DNS试液用量优化

采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)，通过紫外分光光度计测定吸光度，对DNS试液用量进行优化。精密量取供试品溶液1.0 mL于20 mL具塞试管中，补充蒸馏水至2 mL，混匀，分别加入DNS试液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，摇匀后置沸水浴加热，取出后以流水冷却至室温，定容至刻度即可。同时，以水为空白管对照，在(540±2)nm 波长处测定吸光度。结果如图2所示，随着DNS试液用量的增多，吸光度逐渐增大，但当DNS试液加入量>1.5 mL时，吸光度趋于平稳。因此，确定DNS用量1.5 mL为最优。

2.4.3 显色时间的优化

采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)，通过紫外分光光度计测定吸光度，对其显色时间进行优化。精密量取供试品溶液1.0 mL于20 mL具塞试管中，补充蒸馏水至2 mL，混匀，分别加入DNS试液1.5 mL，摇匀后置沸水浴分别加热3、5、7、9、11 min，取出后以流水冷却至室温，定容至刻度即可。同时，以水为空白管对照，在(540±2)nm波长处测定吸光度。结果如图3所示，随着显色时间的延长，吸光度快速升高，并在5 min后达到平稳。因此，确定显色时间为5 min。

图2 DNS试液加入量的影响

图3 显色时间的影响

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液1.0 mL，按照“2.2”项下测定方法显色并测定吸光度，重复测定6次，RSD为0.41%(n=6)。结果表明仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液1.0 mL，按照“2.2”项下测定方法显色，每隔10 min分别测定1次吸光度，60 min内RSD为0.78%(n=6)。结果表明供试品溶液在60 min内稳定性良好。

2.5.3 重复性试验

分别精密称定同一槐角样品，按照“2.1.2”项下分别制备6份供试品溶液，按照“2.2”项下测定方法显色并测定吸光度，计算样品中还原糖含量为2.39%，RSD为2.08%(n=6)。结果表明方法重复性良好。

2.5.4 加样回收率试验

称取槐角样品1 g，共9份，精密称定，分别精密加入D-无水葡萄糖对照品储备液3.0，2.0，1.0 mL，按照“2.1.2”项下分别制备9份供试品溶液。按照“2.2”项下方法显色并测定吸光度，计算平均回收率为98.43%，RSD为1.54%(n=9)。结果表明方法回收率良好。结果见表1。

3 讨论

3.1 关于DNS试液的配制

DNS试液的配制决定了还原糖测定数据的准确、稳定。文献中有关DNS试液的配制有多种方法[3,9-10]，大多数采用文中方法，在实验中笔者发现，DNS的加入需少量多次，缓慢加入，可借助于磁力搅拌，边加边搅拌，否则，一次加入太多，会立即析出大量橙黄色絮状沉淀。此外，配制温度不要超过50 ℃，否则，温度太高，溶液颜色容易变黑。

表1还原糖加样回收率试验结果(n=9)

编号取样量(g)样品含量(mg)加入量(mg)测得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)11.000 223.904 834.200 058.002 399.7021.000 623.914 334.200 058.012 699.7031.000 523.912 034.200 057.992 399.6541.000 623.914 322.800 045.895 696.4151.000 723.916 722.800 046.885 2100.7498.431.5461.000 223.904 822.800 046.032 597.0571.000 523.912 011.400 035.023 697.4781.000 323.907 211.400 035.012 697.4291.000 123.902 411.400 035.045 897.75

3.2 供试品溶液处理方法的筛选

课题组对供试品溶液的处理方法中加热条件、是否除杂等进行优化[11-14]。曾采用沸水浴回流和50 ℃水浴浸提两种方法，结果发现50 ℃水浴浸提效果优于沸水浴回流，可能是由于沸水浴温度太高会造成还原糖的分解。此外，笔者还尝试采用石油醚(60 ℃～90 ℃)对槐角先脱脂除杂，然后再进行50 ℃水浴浸提，实验发现，除杂会降低还原糖的含量，容易造成部分还原糖损失，数据不准确；因此，直接加水浸提，不进行除杂，减少中间繁琐步骤。

3.3 显色方法优化

课题组对影响显色方法的DNS用量和显色时间进行优化，结果DNS试液用量为1.5 mL，沸水浴加热显色时间5 min即可。方法学考察结果表明该方法重现性、稳定性良好，结果可靠。