功能化氧化石墨烯复合膜内葡萄糖氧化酶的生物传感器

陈思 费俊杰 许依婷

摘要：通过氧化石墨烯（GO）与无水甲基乙烯基醚-马来酸酐（PMVMA）共聚物组合制备成复合材料（GO-PMVMA），进一步制备出改性葡萄糖氧化物（GOD）电极以得到一新型葡萄糖氧化酶生物传感器。对修饰电极上GOD直接电化学行为的直接伏安法研究表明，复合膜的GOD显示出一对具有良好峰形的可逆峰。进一步研究了新型葡萄糖传感器的电催化行为。葡萄糖线性检测范围为0.4mM～10.8mM，检测限为0.0871mM（S/N=3）。

关键词：石墨烯;葡萄糖氧化酶;传感器

中图分类号：X13 文献标识码：A 文章编号：2095-672X（2019）09-0-02

DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2019.09.075

Biosensor for glucose oxidase in functionalized graphene oxide composite membrane

Chen Si 1， Fei Junjie 2， Xu Yiting 2

（1. Xiangtan Medical and Technical College， Xiangtan Hunan 411100， China;

2. Key Laboratory of Environmental Friendly， Xiangtan University， Xiangtan Hunan 411100， China）

Abstract：A composite material （GO-PMVMA） is prepared by combining graphene oxide （GO） with PMVMA， and a modified glucose oxide （GOD） electrode is further prepared to obtain a new glucose oxidase biosensor. Direct voltammetry studies on the direct electrochemical behavior of GOD on modified electrodes show that the GOD of the composite film shows a pair of reversible peaks with good peak shape. The electrocatalytic behavior of the novel glucose sensor was further studied. The linear detection range of glucose was 0.4 mM to 10.8 mM with the limit of detection （LOD） of 0.0871 mM.

Keywords： Graphene; Emzyme; Biosensors

葡萄糖氧化酶（GOD）是一种与人类生活密切相关的酶，这是一种同源二聚体，由两个紧密结合的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）辅酶组成[1]。在O2存在下，GOD可以促进葡萄糖的电子转移[2]。葡萄糖在食品、制药和化学工业中占据重要地位，对于精确测定葡萄糖含量非常重要。然而，先前研究的酶传感器制备过程复杂且昂贵。因此，为了获得易于制造和低成本的葡萄糖生物传感器，最重要的是找到合适的材料来固定酶和电极之间的GOD，发生直接电子转移[3-4]。

甲基乙烯基醚 - 马来酸酐共聚物（PMVMA）具有优异的性能，如无毒，溶解性好，化学稳定性，附聚，附着力和良好的成膜特性[5]，以其制备的混合材料与电极的粘附增强，对电极上的葡萄糖氧化酶起固定作用，并改善了修饰电极的稳定性和寿命。通过混合PMVMA和GO获得的电极改性材料改善了酶的生物相容性环境并增强了生物传感器的稳定性。

1 实验部分

1.1 实验试剂及仪器

葡萄糖氧化酶（GOD），Sigma;甲基乙烯基醚共聚马来酸（PMVMA），阿拉丁;抛光粉，CHI;葡萄糖、石墨粉、高锰酸钾、浓硫酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，以上药品均来自国药集团化学试剂有限公司。

扫描电镜SEM，JEOL JSM-6610Lv型，日本; CHI 660D型电化学工作站，上海辰华仪器公司。

1.2 修饰材料的制备

1.2.1氧化石墨烯（GO）的制备

实验所用到的氧化石墨烯（GO）是采用Hummers and Offeman方法，以石墨粉为原料利用高锰酸钾作为氧化剂制备得到[6]。

1.2.2GO-HPEG复合材料的制备

将20mg HPEG，10mg GO溶于10ml水中，超声处理1h，并在80℃下反应24h。将反应溶液抽滤并干燥以制备4mg/L GO-HPEG混合溶液。

2 结果与讨论

2.1 扫描电镜表征

电极修饰材料的表面形态通过扫描电子显微镜（SEM）进行表征，如图1所示，氧化石墨烯GO（图a）在图中显示出均匀的层状结构合成良好，可在玻碳电极上形成均匀的薄膜。GO-PMVMA复合薄膜（图b）显示出特定的颗粒度，表明PMVMA与GO之间存在直接的相互作用。GO-PMVMA / GOD复合膜（图c）显示清晰的粒度，表示GOD和PMVMA-GO混合物之间结合紧密，进一步说明GOD已成功固定在GO-PMVMA复合物上。

2.2PMVMA-GO/GOD/GCE的直接电化学

每个修饰电极直接电化学特征采用循環伏安法进行表征。底部溶液是pH 7.0的氮饱和pH（PBS）溶液，扫描速度为100 mV / s。从图2中可以看出，GCE（曲线b），PMVMA-GO / GCE（曲线d），PMVMA / GOD / GCE（曲线）没有氧化还原峰值电流。GO / GOD / GCE（曲线c）具有小的峰值电流，但峰的形状是不对称的，尾峰很大。相比之下，在相同条件下，只有PMVMA-GO / GOD / GCE（e曲线）具有一对良好峰形的氧化还原峰，且有较大的峰值电流和中等强度的尾峰和背景电流，同时氧化峰值电位和还原峰值电位分别为-0.448 V和-0.482 V，峰值电位差为0.034 V。氧化峰值电流和还原峰值电流（ipa和ipc）基本相等，PMVMA-GO复合膜充分固定GOD，很好的促进GOD电活性中心与电极表面之间的电子转移，为GOD保留了生物活性，提供适合GOD直接电化学行为的微环境。

图3是PMVMA-GO / GOD / GCE修饰电极的循环伏安图，底液采用pH7.0的PBS的氮饱和缓冲溶液，从内到外以25至250mV / s的掃描速率叠加，每次速度增加25mv / s，随着扫描速度的变化，GOD的氧化还原峰电位几乎没有变化。从内插图中可以看出，还原峰电流ipc和氧化峰电流ipa随扫描速度的增加呈线性增加。表明在PMVMA-GO / GOD复合膜中，GOD与玻碳电极之间易于实现直接电子转移，且本过程是一个表面控制过程。由法拉第公式：Q=nFAГ*，计算出改性PMVMA-GO / GOD / GCE电极面积Г*为2.129×10-11 mol·cm2。随后，根据laviron模型研究，nΔEp小于200mV。根据公式ks=mnFv/RT，计算GOD在复合膜PMVMA-GO / GOD中的直接电子转移动力学，GOD与电极之间的电子转移速度ks计算为1.701 s-1，大于Cai C X[7]研究的Nafion-GOD-CNT修饰电极 （1.53 s-1）、 Tu X [8]研究的CNTs-IDA-Co-GOD修饰电极（0.59 s-1），表明GOD在GO-HPEG / GOD上修饰电极是一种快速的电子转移过程。图3为PMVMA-GO/GOD/GCE在扫描速度为25、50、75、100、125、150、175、200、225、250 mV·s-1（从内到外）下的循环伏安图。内插图为PMVMA-GO/GOD/GCE峰电流与扫速的线性关系。

3 结论

在PMVMA-GO复合薄膜中固定GOD，制备简单，价格低廉，环境友好。实验结果表明，GO和PMVMA可以加速PMVMA-GO复合薄膜的电子转移。葡萄糖生物传感器具有良好的性能。葡萄糖生物传感器的催化活性好、稳定性好、线性范围宽、重现性高、检出限低，提供了良好的第三代生物传感器平台。

参考文献

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[2] Mano N， Mao F， Heller A. Electro-oxidation of glucose at an increased current density at a  reducing potential.[J]. Chemical Communications， 2004， 10（18）： 2116-2117.

[3]Ying Z， Ya-Qin C， Ruo Y， et al. Glucose oxidase and ferrocene labels immobilized at Au/TiO2 nanocomposites with high load amount and activity for sensitive immunoelectrochemical measurement of ProGRP biomarker.[J]. Biosensors & Bioelectronics， 2011， 26（9）：3838-3844.

[4] Gao R， Zheng J. Amine-terminated ionic liquid functionalized carbon nanotube-gold nanoparticles for investigating the direct electron transfer of glucose oxidase[J]. Electrochemistry Communications， 2009， 11（3）：608-611.

[5]Endo Toshio， Fujii Tatsum， Tsuji Yasuo， et al. Method for producing copolymer of alkylvinyl ether and maleic anhydride， and copolymer of alkylvinyl ether and maleic anhydride[P]. US： 20020086964，2002.

[6] Hummers W S， Offeman R E， Hummers W S， et al. Preparation of Graphitic Oxide. J Am Chem Soc 80：1339[J]. Journal of the American Chemical Society， 1958， 80（6）： 1339.

[7] Cai C X， Chen J. Direct electron transfer of glucose oxidase promoted by carbon nanotubes [J]. Anal. Biochem.， 2004， 332（1）： 75-83.

[8] Tu X M， Zhao Y J， Luo S L， et al. Direct electrochemical sensing of glucose using glucose oxidase immobilized on functionalized carbon nanotubes via a novel metal chelate-based affinity method [J]. Microchim. Acta， 2012， 177：159-166.

收稿日期：2019-05-24

作者简介：陈思（1991-），女，汉族，研究生，助教，研究方向为电分析化学。