响应面优化马鲛鱼鱼皮胶原蛋白的提取工艺

□ 朱航 福建农林大学食品科学学院 泉州师范学院海洋与食品学院

□ 戴聪杰（通讯作者） 泉州师范学院海洋与食品学院

马鲛鱼肉质细嫩，营养丰富，含有脂质、蛋白质和矿物质等营养成分，既是宝贵的海洋生物资源，也是一种经济价值较高的海产优质鱼类，其主要分布于我国东海、黄海、渤海等海域[1]。我国作为渔业大国，水产品加工处理所产生的下脚料(鱼皮、鱼骨、鱼内脏等)远远超过原材料的加工部分[2]，而这些下脚料也拥有着丰富的胶原蛋白、钙质、鱼油等资源。如水产品加工处理后的下脚料能够得到充分利用，不仅可以增加鱼类的经济价值，更有利于环境的绿色发展。其中，由于胶原蛋白具有止血增生、生物降解、生物相容、抑制衰老、美容护肤等作用，故深受研究者的青睐[3]。胶原蛋白常用的提取方法有热水抽提法、酸提法、酶提法、盐提法和碱提法等，且不同方法有各自的优缺点[4-5]。本研究拟采用热水浸提法和酸提法，以马鲛鱼下脚料——鱼皮为材料，提取马鲛鱼鱼皮胶原蛋白，以期优化马鲛鱼鱼皮胶原蛋白的提取工艺，为马鲛鱼高值化提供理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：福建省崇武县某鱼卷加工企业提供的马鲛鱼新鲜鱼皮，在-20℃以下环境中保存。

试剂：乙酸、L-羟脯氨酸、硫酸、一水柠檬酸、氢氧化钠、无水乙酸钠、氯胺T、对二甲氨基苯甲醛、正丙醇、异丙醇、高氯酸、壳聚糖，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

数显恒温水浴锅，HH-4A型，常州国华电器有限公司；

分光光度计，V-1800型，上海美谱达仪器有限公司；

冷冻低俗离心机，L535R型，湘仪离心机有限公司；

IKA手握式组织匀浆机，T10 basic型，艾卡仪器设备有限公司；

多通道智能加热磁力搅拌器，SP200-2T型，杭州米欧仪器有限公司；

电脑恒温层析柜，CXG-1型，上海青浦沪西仪器厂；

1.3 试验方法

1.3.1 鱼皮的预处理

新鲜的马鲛鱼鱼皮中含有大量的鱼肉、鱼刺、脂肪等杂质，通过手工处理和试剂浸泡——经H2O2和NaOH等加工处理进行脱脂肪、脱腥、脱杂蛋白[6-7]，做到无损害处理鱼皮。

1.3.2 热水浸提法[8-9]的单因素试验

通过预实验确定热水浸提法单因素试验的基本条件为：料液比1∶60、浸提温度50℃、浸提时间6h，通过控制变量来分析各单因素对鱼皮胶原蛋白提取率的影响。称取0.5g鱼皮溶胀，在浸提温度50℃、浸提时间6h条件下，料液比分别以1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90匀浆提取；在料液比为1∶60、浸提时间为6h条件下，温度分别采用30、40、50、60、70、80℃匀浆提取；在料液比1∶60、浸提温度50℃条件下，浸提时间设置为3、4、5、6、7、8h匀浆提取。然后测定羟脯氨酸浓度，计算胶原蛋白提取率。

1.3.3 酸提法[10-11]的单因素试验

通过预实验确定酸提法单因素试验的基本条件为：料液比1∶70、乙酸浓度0.5mol/L、浸提时间12h，通过控制变量来分析各单因素对鱼皮胶原蛋白提取率的影响。称取0.5g鱼皮溶胀，在乙酸浓度0.5mol/L、浸提时间12h条件下，料液比以1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100匀浆提取；在料液比1∶70、浸提时间12h条件下，乙酸浓度采用0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0mol/L匀浆浸提；在料液比1∶70、乙酸浓度0.5mol/L条件下，浸提时间设置为3、6、9、12、15、18 h匀浆提取，且提取均处于4℃下磁力搅拌。然后测定羟脯氨酸浓度，计算胶原蛋白提取率。

1.3.4 马鲛鱼胶原蛋白提取率的测定

马鲛鱼鱼皮处理完毕后，在5000r/min冷冻离心20min后取若干体积上清液，采用国标测定羟脯氨酸法[12]绘制羟脯氨酸标准曲线，并进行马鲛鱼鱼皮胶原蛋白提取率的测定。（注：羟脯氨酸为胶原蛋白特异性氨基酸，若显色过程出现白色沉淀而未出现正常红色显色反应，需在测定前调整水解液的pH值，避免等电点。）

胶原蛋白提取率（%）=提取液中羟脯氨酸含量×11.1/鱼皮中胶原蛋白理论含量×100（式中：11.1为换算系数[13]）

1.3.5 响应面分析

图1 L-羟脯氨酸标准曲线

根据单因素试验结果，结合Design Expert8.0软件选取合适的参数进行响应面分析，对马鲛鱼鱼皮胶原蛋白提取率进行二次多项回归拟合[14-15]，得出最优的马鲛鱼鱼皮胶原蛋白提取工艺。

2 结果与分析

2.1 羟脯氨酸标准曲线的测定

羟脯氨酸的标准线性回归方程为：Y=0.22X＋0.0062，相关系数R2=0.999，说明该线性回归方程具有意义，试验所得吸光度可以换算成羟脯氨酸含量。

2.2 料液比、浸提时间、浸提温度对马鲛鱼鱼皮胶原蛋白热水浸提法的影响

图2 料液比、浸提时间、浸提温度对热水浸提法的影响

图3 料液比、浸提时间、乙酸浓度对酸提法的影响

由图2可知，在浸提温度50℃、浸提时间6h条件下，当料液比较低时，鱼皮匀浆不能充分地分散于体系之中，导致胶原蛋白提取率偏低；随着料液比增加，提取率开始逐步增大；当料液比为1∶70时提取率最高，其后提取率出现轻微波动，其可能是匀浆过程不彻底或测定处理的操作不当等原因导致。在料液比1∶60，浸提时间6h条件下，提取率随温度的升高迅速提高，在50℃时出现峰值；而后开始逐渐降低，这可能由于浸提温度过高，鱼皮的胶原纤维组织发生收缩现象，使胶原蛋白被束缚在鱼皮组织之中无法溶出。在料液比为1∶60、浸提温度为50℃条件下，提取率先快速上升而后趋近平缓或轻微降低，在6h左右提取率达到最大；之后，随着浸提时间增加，鱼皮匀浆液出现的悬浮物质开始增多，可能导致在后续分离处理中提取率下降。故选取1∶60、1∶70、1∶80，40℃、50℃、60℃，5h、6h、7h为响应面试验的因素水平。

2.3 料液比、浸提时间、乙酸浓度对马鲛鱼鱼皮胶原蛋白酸提法的影响

由图3可知，在乙酸浓度0.5mol/L、浸提时间12h条件下，当料液比较低时，鱼皮样品不能完全浸泡在乙酸溶液中，胶原蛋白提取率不充分；随着料液比增加，提取率开始逐步增大，当料液比为1∶70时提取率最高；其后提取率出现轻微波动，胶原蛋白含量基本没有增加。在料液比1∶70、浸提时间12h条件下，较低浓度的乙酸溶液有着可观的提取率；随着乙酸浓度逐渐增加，提取率先快速上升而后开始逐渐降低，在乙酸溶液为0.5mol/L时提取率最高；出现此现象可能由于胶原蛋白在较低pH值的环境下会发生变形，不利于溶出。在料液比1∶70、乙酸浓度0.5mol/L条件下，提取率随时间的延长迅速提高，在12h时提取率最大，而后开始缓慢降低，这可能由于随着浸提时间增加，鱼皮肌原纤维结构在酸性溶液中逐渐溶胀，促进胶原蛋白溶出，但是时间过长会导致鱼肉组织悬浮物增多，影响后续的分离，使胶原蛋白造成浪费。故选取1∶60、1∶70、1∶80，0.4mol/L、0.5mol/L、0.6moL/L，9h、12h、15h 为响应面试验的因素水平。

表1 热水浸提法的实验设计与结果

2.4 马鲛鱼鱼皮胶原蛋白提取条件响应面优化

2.4.1 热水浸提法

试验设计与结果分别见表1、图4。以料液比（A）、温度（B）、时间（C）作为响应因子，马鲛鱼鱼皮胶原蛋白提取率作为指标，软件分析得出二次回归方程：马鲛鱼鱼皮胶原蛋白提取率(%)=+87.36+4.75A+4.98B+3.68C+4.17AB+4.08AC+1.78BC-8.47A2-9.22B2-6.77C2，此法胶原蛋白提取率模型p＜0.05，表明该模型显著；失拟项p＝0.632＞0.05不显著，说明此模型回归方程拟合度较高。

图4 料液比（A）、温度（B）、时间（C）对马鲛鱼胶原蛋白提取率的影响

2.4.2 酸提法

试验设计与结果分别见表2、图5。以料液比（A）、乙酸浓度（B）、时间（C）作为响应因子，马鲛鱼鱼皮胶原蛋白提取率作为指标，得出二次回归方程：马鲛鱼鱼皮胶原蛋白提取率(%)=+67.6+0.51A+0.56B+1.33C+0.52AB+0.25AC+0.25BC-1.76A2-1.76B2-1.54C2，此法胶原蛋白提取率模型p＜0.05，表明该模型显著；失拟项p＝0.9995＞0.05不显著，说明此模型回归方程拟合度较高。

表2 酸提法的实验设计与结果

图5 料液比（A）、乙酸浓度（B）、时间（C）对马鲛鱼胶原蛋白提取率的影响

3 结论

胶原蛋白的提取可以采用不同方法，而不同的方法又各有优缺点，因此不能仅将提取率这一项指标作为判断依据，还需进一步研究对鱼皮胶原蛋白提取方法加以说明。本文采用热水浸提法和酸提法提取马鲛鱼鱼皮胶原蛋白，结合单因素和响应面分析对提取工艺进行优化，结合实际情况得出热水浸提法的最佳提取条件为：料液比1∶75、浸提温度55℃、浸提时间6.5h，胶原蛋白提取率达到90.5%；酸提法最佳提取条件为：料液比1∶70、乙酸浓度0.5mol/L、时间13.5h，胶原蛋白提取率达到68.0%。在此基础上进行平行实验加以验证发现误差较小，说明模型拟合度高，可以较好地体现两种方法对马鲛鱼鱼皮胶原蛋白提取的情况。