miR-128-3p靶向TCF4抑制黑色素瘤A375细胞增殖、侵袭和上皮-间充质转化*

侯绍蔚， 张连清， 席海英， 赵爱玲， 侯 恒

(1山西大同大学医学院, 2大同市第五人民医院皮肤科, 3大同市第五人民医院神经内科， 山西 大同 037009)

黑色素瘤是一种恶性程度很高的肿瘤，是最致命的皮肤癌，其2年生成率为15%，5年生成率仅为5%。病理研究表明，黑色素瘤内有很多免疫细胞，可以据此开发针对免疫系统的治疗药物。近年来，利用人体自身免疫系统靶向治疗的方法已初见成效[1-3]。研究表明，机体内各种肿瘤都存在对应的原癌基因和抑癌基因，原癌基因被激活、抑癌基因被抑制与肿瘤的发生有直接关系[4]。研究表明，微小RNA-128-3p(microRNA-128-3p,miR-128-3p)可以通过靶向抑癌基因抑制T淋巴细胞白血病、肝癌细胞和神经胶质瘤的增殖，其低表达可能提示患者的不良预后[5-8]。Wnt信号通路通常与机体器官发生相关，转录因子4(transcription factor 4，TCF4)是其重要调节蛋白，高表达TCF4可异常激活该通路使β-catenin转移到细胞核内，竞争性结合TCF4，形成β-catenin/TCF4复合物，与此同时聚集且激活TCF4下游的转录因子，最终导致细胞异常增殖和肿瘤发生[9-12]。本文以人黑色素瘤A375细胞为研究对象，探究高表达miR-128-3p对黑色素瘤A375细胞增殖、侵袭和上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的调控作用及其作用机制。

材 料 和 方 法

1 试剂与仪器

DMEM细胞培养液、0.25%胰酶和胎牛血清均购自Gibco；miR-128 mimic和pcDNA-TCF4(pc-TCF4)由上海吉玛生物设计合成；Lipfectamine 2000转染试剂盒、TRIzol试剂盒、反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购自Thermo Fisher；I抗和II抗均购自Abcam；RIPA裂解液购自Sigma；BCA试剂盒购自碧云天生物科技公司；Dual-Luciferase® Report报告基因试剂盒购自Promega；EdU试剂盒购自广州锐博生物有限公司；Matrigel购自Invitriogen。

PCR仪、电泳仪及半干转膜仪均购自美国伯乐公司；Gel View 6000化学发光凝胶成像系统购自广州云星仪器有限公司。

2 方法

2.1细胞培养 人恶性黑色素瘤A375细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。用含有10% 胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，根据细胞生长情况，融合率达到85%以上进行传代培养。

2.2细胞转染 将细胞传代培养于12孔板中，用培养液将细胞密度调整为1×109/L，每孔接种1 mL细胞悬液。将培养板置于上述培养条件下培养24 h后，根据转染试剂盒说明书采用Lipofectamine 2000将miR-128 mimic和/或pc-TCF4转染到A375细胞，转染4 h后更换正常培养液继续培养，48 h后进行相关检测。

2.3RT-qPCR 将细胞随机分为对照(control)组和miR-128 mimic组。control组加入正常细胞培养液进行培养，miR-128 mimic组加入含有miR-128 mimic的转染液进行培养。48 h后用Trizol试剂提取细胞RNA，用反转录试剂盒合成miR-128-3p的cDNA，进行PCR扩增后，根据荧光定量PCR试剂盒对cDNA进行检测，以GAPDH为内参照。实验所用引物由上海生工设计合成。miR-128-3p 上游引物序列为5’-UCACAGUGAACCGGUCUCUUU-3’，下游引物序列为5’-AGAGACCGGUUCACUGUGAUU-3’；GAPDH的上游引物序列为5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’，下游引物序列为5’-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3’。

2.4萤光素酶报告基因实验 首先，通过生物信息预测TCF4在miR-128-3p上的结合位点，并对结合位点片段进行扩增。随后将扩增片段插入pcDNA载体上，构建TCF4野生型质粒。利用基因位点突变技术将结合位点片段中部分核苷酸突变，构建TCF4突变型质粒。用TCF4野生型质粒或TCF4突变型质粒和miR-128 mimic对A375细胞进行共转染，根据Dual-Luciferase® Report报告基因试剂盒说明书检测各组萤光素酶活性。

2.5EdU染色检测细胞增殖 取第3代A375细胞，接种于96孔板内，每孔接种2×107/L细胞悬液200 μL，细胞贴壁后，换终浓度为10 μmol/L的EdU培养液，孵育48 h，每组设3个重复孔。弃去培养液，PBS清洗，多聚甲醛固定30 min，按照说明书加入Apollo染色反应液30 min后，再加入Hoechst染色反应液30 min，最后用PBS清洗1遍。每组每个孔随机取3个视野在荧光显微镜下观察计数并拍照。EdU阳性细胞在绿光激发下发红色荧光，Hoechst阳性细胞在紫外光激发下发蓝色荧光。EdU阳性细胞标记率(%)=发红色荧光细胞数/发蓝色荧光细胞数×100%。

2.6细胞侵袭实验 将转染后细胞传代接种于提前用Matrigel包被的Transwell小室上层，细胞密度为4×108/L，用不含胎牛血清的培养液培养，Transwell小室下层则加入正常细胞培养液。连续培养48 h后用无菌棉签拭去小室上层细胞，用结晶紫将迁移至小室下层的A375细胞染色，每组随机选取5个视野对染色细胞进行基数统计。实验至少重复3次，每组6个复孔。

2.7Western blot实验 将细胞随机分为control组、miR-128 mimic组、pc-TCF4组和miR-128 mimic+pc-TCF4(mimic+pc-TCF4)组，用miR-128 mimic和/或pc-TCF4转染A375细胞后，用RIPA蛋白裂解液于冰上提取各组细胞总蛋白，用BCA试剂盒检测各组蛋白浓度并调平。每组取等量蛋白质用12% SDS-PAGE分离蛋白后，转移蛋白质到PVDF膜。用5%脱脂牛奶室温封闭蛋白质2 h，以1 ∶1 000的浓度加入抗TCF4、E-cadherin、vimentin、cyclin D和c-Myc的I抗，4 ℃孵育过夜。第2天弃去I抗，用缓冲液清洗PVDF膜后，加入II抗，室温封闭1 h后，滴加ECL于暗室曝光显影。以GAPDH为内参照。

3 统计学处理

用统计软件SPSS 19.0对所有实验数据进行统计分析，组间差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行检验。实验结果以均数±标准差(mean±SD)表示。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 miR-128-3p与TCF4的靶向关系

生物信息预测结果显示，miR-128-3p序列上存在连续的TCF4结合位点，见图1A。同时，采用萤光素酶报告实验进一步确定了miR-128-3p和TCF4的靶向关系。实验结果显示miR-128-3p能显著降低TCF4野生型质粒的萤光素酶活性(P<0.01)，当TCF4上结合位点突变后，miR-128-3p对TCF4质粒萤光素酶活性的抑制作用消失，见图1D。

Figure 1.Targeting relationship between miR-128-3p and TCF4. Mean±SD.n=9.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vspc-TCF4 group;△△P<0.01vspc-TCF4 wt group.

图1 miR-128-3p与TCF4的靶向关系

2 过表达miR-128-3p对黑色素瘤A375细胞表达TCF4的影响

RT-qPCR和Western blot实验结果表明，miR-128 mimic组miR-128-3p的表达水平较control组显著升高(P<0.01)，见图1B，说明过表达成功。与control组比较，miR-128 mimic组的TCF4相对蛋白表达水平显著降低(P<0.01)，pc-TCF4组的TCF4相对蛋白表达水平显著升高(P<0.01)；同时，miR-128 mimic+pc-TCF4组与pc-TCF4组相比较，TCF4的相对蛋白表达水平显著降低(P<0.01),见图1C，提示过表达miR-128-3p可以靶向抑制黑色素瘤A375细胞TCF4的蛋白表达。

3 过表达miR-128-3p抑制黑色素瘤A375细胞增殖

EdU标记的A375细胞孵育48 h后，镜下观察EdU阳性细胞数量。结果显示，与control组比较，miR-128 mimic组的阳性细胞标记率显著降低(P<0.01)，而pc-TCF4组的阳性细胞标记率显著升高(P<0.01)，同时，mimic+pc-TCF4组的阳性细胞标记率较pc-TCF4组显著降低(P<0.01)，见图2。这提示miR-128-3p可以通过靶向调节TCF4的表达抑制黑色素瘤A375细胞的增殖。

Figure 2.The effect of miR-128-3p on the proliferation of melanoma A375 cells (Apollo and Hoechst staining, ×400). Mean±SD.n=9.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vspc-TCF4 group.

图2 miR-128-3p对黑色素瘤A375细胞增殖的影响

4 过表达miR-128-3p抑制黑色素瘤A375细胞的侵袭能力

采用侵袭实验检测过表达miR-128-3p对黑色素瘤A375细胞侵袭能力的影响，结果表明与control组比较，miR-128 mimic组的侵袭细胞数显著减少(P<0.01)，而pc-TCF4组侵袭细胞数显著增加(P<0.01)；同时，mimic+pc-TCF4组与pc-TCF4组比较，侵袭细胞数显著减少(P<0.01)，见图3。这表明miR-128-3p可通过抑制TCF4的表达降低黑色素瘤A375细胞的侵袭能力。

Figure 3.The effect of miR-128-3p on the invasion ability of melanoma A375 cells (crystal violet staining, ×400). Mean±SD.n=9.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vspc-TCF4 group.

图3 miR-128-3p对黑色素瘤A375细胞侵袭能力的影响

5 过表达miR-128-3p抑制黑色素瘤A375细胞EMT的发生

将各组细胞置于倒置显微镜下观察细胞形态可见，与control组比较，miR-128 mimic组细胞形态多呈卵圆形或方形，排列紧密；pc-TCF4组细胞形态多呈长梭形，排列疏松；而mimic+pc-TCF4组较pc-TCF4组相比，细胞形态多呈梭形，但细胞排列更为紧密，见图4A。

Western blot检测转染miR-128-3p后对黑色素瘤A375细胞EMT标志物表达的影响，结果显示与control组比较，miR-128 mimic组的E-cadherin表达水平显著升高，vimentin表达水平显著降低(P<0.01)。而与control组比较，pc-TCF4组E-cadherin表达水平显著降低，vimentin表达水平显著升高(P<0.01)。与pc-TCF4组相比，mimic+pc-TCF4组E-cadherin表达水平显著升高，vimentin蛋白表达水平显著降低(P<0.01)，见图4B。

综上所述，miR-128-3p可通过抑制间充质标志蛋白vimentin、增加上皮标志蛋白E-cadherin的表达而抑制A375细胞的EMT能力。

Figure 4.The effect of miR-128-3p on EMT of melanoma A375 cells. Mean±SD.n=9.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vspc-TCF4 group.

图4 miR-128-3p对黑色素瘤A375细胞EMT的影响

6 过表达miR-128-3p抑制黑色素瘤A375细胞TCF4下游靶基因的蛋白表达

Western blot检测转染miR-128-3p后对黑色素瘤A375细胞TCF4下游分子cyclin D和c-Myc表达的影响，结果显示,与control组比较，miR-128-mimic组cyclin D和c-Myc的蛋白表达水平均显著降低(P<0.01)，而pc-TCF4组两者的表达水平均显著升高(P<0.01)；同时，mimic+pc-TCF4组两者的表达水平较pc-TCF4组显著降低(P<0.01)，见图5。这提示过表达miR-128-3p可以显著抑制TCF4下游分子cyclin D和c-Myc的表达水平。

Figure 5.The effects of miR-128-3p on the protein expression of cyclin D and c-Myc in the melanoma A375 cells. Mean±SD.n=9.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vspc-TCF4 group.

图5 miR-128-3p对黑色素瘤A375细胞cyclin D和c-Myc蛋白表达的影响

讨 论

研究表明，人体有超过60%的蛋白质编码基因上都具有miRNAs的结合位点，在细胞生长、增殖、凋亡和迁移过程中具有重要的调控作用，同时可以通过调控蛋白编码基因的表达影响癌症的发生和发展[13-14]。但是miR-128-3p与TCF4的靶向关系还未得到证实。本实验研究表明，miR-128-3p可以靶向结合TCF4而抑制其表达，而pc-TCF4能明显减弱miR-128-3p对TCF4表达的抑制作用。

影响肿瘤细胞增殖是miRNAs抑制肿瘤/癌症发生发展的重要机制。大量研究表明，miR-199a/b-3p在多种癌症中表现出抑癌基因和抑制细胞增殖的作用，包括肝癌、甲状腺乳头状癌、子宫内膜样腺癌、肾细胞癌、骨肉瘤、卵巢癌和胃癌[4]。双萤光素酶报告分析证实miR-330-3p靶向TPX2,负向调节TPX2的表达，从而抑制黑色素瘤细胞的增殖[15]。miR-128-3p也可以通过靶向抑癌基因抑制T淋巴细胞白血病、肝癌细胞和神经胶质瘤的增殖[5-8]。靶向调控TCF4可以抑制人成纤维细胞的增殖[16]。为了探讨miR-128-3p能否通过靶向TCF4调控黑色素瘤A375细胞的增殖能力，本实验发现，TCF4能促进A375细胞增殖，但miR-128-3p能通过靶向抑制TCF4的表达而降低黑色素瘤A375细胞的增殖。

另外，研究表明，可通过调控miR-128-3p的表达抑制基底细胞样乳腺癌细胞迁移[17]，同时miR-128-3p的过表达也可以靶向调节DJ-1基因的表达而促进肝癌细胞的凋亡，从而对抗癌药索拉菲尼产生较好的反应[18]，且miR-128-3p可以抑制高度恶性非小细胞肺癌的转移和耐药性[19]。但miR-128-3p对黑色素瘤细胞迁移能力的影响还未见报道。本文研究发现，黑色素瘤A375细胞过表达miR-128-3p后侵袭细胞数量明显减少，说明miR-128-3p能抑制黑色素瘤A375细胞的侵袭，同时，过表达TCF4后，侵袭细胞数量明显增加。说明，TCF4能增强A375细胞的侵袭能力，但miR-128-3p能通过靶向抑制TCF4的表达而抑制A375细胞的侵袭能力。

EMT是指上皮细胞失去极性和细胞获得间充质特性从而增加细胞转移和侵袭能力的过程[20-21]，是多种肿瘤发生转移和侵袭的重要过程。E-cadherin被认为是此过程的基础，E-cadherin参与并介导细胞之间相互黏附，是一种重要的细胞黏附因子，与多种肿瘤的侵袭和转移有不可分割的联系，它的低表达或者表达缺失被认为是肿瘤EMT的关键步骤[22]。研究发现[23]，犬肾脏上皮细胞过度表达TCF4能增加细胞侵袭能力，从而加速肿瘤EMT的发生，其中可见上皮标志蛋白E-cadherin的明显下调和间充质标志蛋白vimentin的表达上升。miR-128-3p能作为肿瘤抑制因子通过靶向ZEB1抑制食管鳞状细胞癌的转移和EMT[24]。另有报道称，通过下调Wnt/β-catenin信号通路，miR-128-3p可以抑制非小细胞肺癌EMT[19]。为了证明miR-128-3p能否靶向TCF4抑制黑色素瘤细胞的EMT，我们通过实验发现：在倒置显微镜下，过表达miR-128-3p的细胞形态呈卵圆形或方形并且排列紧密；同时可高表达上皮标志蛋白E-cadherin,低表达间充质标志蛋白vimentin，而TCF4可以减弱miR-128-3p对E-cadherin和vimentin的调节作用。这说明在A375细胞中miR-128-3p可抑制A375细胞之间极性丧失，阻止其向间充质细胞发展，降低细胞的侵袭和转移能力，抑制A375细胞EMT的发生。

当Wnt信号通路激活时，β-catenin转移到核内竞争性结合TCF4形成β-catenin/TCF4复合物，激活TCF4下游的转录因子，如cyclin D和c-Myc，最终导致细胞异常增殖和肿瘤发生[10]。研究表明，Wnt信号的突变异常激活TCF4靶基因可以促进结直肠癌的恶性转化[25]。本实验过表达miR-128-3p后发现黑色素瘤A375细胞内cyclin D和c-Myc蛋白表达水平均有明显下调，但同时表达TCF4后，两者的表达水平明显上调。这说明miR-128-3p能靶向抑制TCF4对cyclin D和c-Myc蛋白表达水平的上调作用。

综上所述，本文初步探讨了miR-128-3p在黑色素瘤A375细胞增殖、侵袭和EMT中的作用，说明miR-128-3p可以通过靶向抑制TCF4表达而实现对A375细胞增殖、侵袭和EMT的抑制作用，为进一步研究miR-128-3p在肿瘤发生发展过程中的作用提供了新的思路。