姜黄素对ERS诱导NASH大鼠肝细胞保护作用的研究*

李 敏， 黄婷婷， 姜双燕， 杨 洋， 陈莎莎， 张文佳， 赵丽娟

(1锦州医科大学研究生学院， 辽宁 锦州 121001; 2燕达医院消化内科， 北京 101601;3锦州医科大学附属第三医院消化科， 辽宁 锦州 121000)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver di-sease，NAFLD)是全球最常见的慢性肝病之一，成人患病率介于6.3%～45%，其中10%～30%可发展为非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)[1]。NASH是全球范围内较为严重的一种NAFLD病理类型[2]，发展成为肝纤维化、肝硬化等的风险性大。Herbert等[3]提出的“多重平行打击”认为NASH是多种机制共同作用的结果，较为准确地解释了NASH的发病机制，提出包括内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)、细胞凋亡、自噬、相关脂肪因子紊乱和肠道菌群因素等在内的多种因素参与了其发病过程。蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)是内质网上的一种跨膜蛋白，随着内质网中错误及非折叠蛋白量的积累，葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)从PERK上脱离下来，大量PERK通过自身磷酸化被激活，空出的GRP78过表达还会进一步促进PERK的激活[4]。激活的PERK使得真核细胞翻译起始因子2α(eukaryotic initiation factor-2α,eIF-2α)第51位的丝氨酸磷酸化，使其磷酸化而被激活[5-7]。正常情况下，eIF-2α无磷酸化，活化转录因子4(activating transcription factor 4, ATF4)上游5’端存在抑制ATF4翻译的特定区域；只有当eIF-2α磷酸化时才可直接翻译ATF4。ATF4下游是转录因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白[CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) homologous protein, CHOP]，是ERS引发凋亡的信号。研究表明NASH的发病过程中，大量的游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)介导脂质过氧化反应，并通过PERK-eIF-2α-ATF4-CHOP通路导致肝细胞发生凋亡坏死[8],这条通路中GRP78和CHOP被认为是其中重要的标志性信号[9]。

由于NASH发病机制极其复杂，临床至今仍缺乏针对其发病机制的药物。研究表明，姜黄素(curcumin)能抑制肝细胞凋亡来减轻肝脏损伤[10]，同时过度的ERS参与了肝细胞凋亡的发生[9]。目前姜黄素的肝脏保护作用是否与ERS有关鲜有报道[11]。本项工作主要通过分子生物学的方法，探讨姜黄素对ERS诱导的NASH大鼠肝细胞的保护作用是否与抑制ERS中的PERK通路有关，为临床上NASH的治疗提供实验依据。

材 料 和 方 法

1 动物

选取SPF级6周龄SD雄性大鼠30只，体重(200±10) g，购自锦州医科大学实验动物中心，许可证号为SCXK(辽)2017-0003。

2 主要试剂

普通饲料：由锦州医科大学实验动物中心提供；高脂食物组成：79.5%玉米面(粮食杂货店)+0.5%胆固醇(河南万邦实业有限公司，批号：2017031625)+20%猪油(粮食杂货店)；姜黄素(上海瑞永生物科技有限公司)；甲醛溶液(沈阳天罡化学试剂厂)；抗GRP78和CHOP抗体(沈阳万类生物有限公司)；PVDF膜(Millipore)；SDS-PAGE凝胶(武汉博士德生物有限公司)。

3 主要方法

3.1建立模型 30只雄性SD大鼠适应性喂养1周后，将其随机分为3组，分别为正常对照(normal control)组(n=10)、模型(model)组(n=10)及姜黄素(curcumin)组(n=10)。各组均行普通饲料喂养，模型组与姜黄素组在普通饲料喂养基础上予高脂食物(3 ml·kg-1·d-1)灌胃4周，正常组予等量生理盐水灌胃，喂养4周后，每组随机处死2只大鼠，留取血液行肝功能检测、肝组织行病理学检测。观察到模型组及姜黄素组大鼠丙氨酸转氨酶(alanine ami-notransferase, ALT)和天冬氨酸转氨酶(aspartate ami-notransferase, AST)较正常对照组显著升高，同时，光镜下可见明显肝细胞脂肪变性及大量炎细胞浸润，造模成功[11]。

3.2药物干预 从第5周开始，在喂养方法不变基础上，姜黄素组给予姜黄素灌胃，给药剂量为200 mg·kg-1·d-1，模型组与正常对照组予等量生理盐水灌胃，灌胃4周，第8周末结束实验。称重，禁食12 h后麻醉，解剖，采心脏血，检测ALT和AST；迅速取出肝脏并称重，取部分肝脏组织制作石蜡切片，另一部分肝脏组织至于-80 ℃冰箱中用于制作肝组织匀浆。

3.3检测方法 (1)生化检测：全自动生物化学分析仪检测ALT和AST水平；(2)病理组织学：制作石蜡切片，行HE染色，光镜下观察肝脏脂肪变性及炎症程度；(3)Western blot检测：精确称取相同部位的肝脏组织300 mg，制备肝组织匀浆，检测GRP78和CHOP蛋白的表达；(4)TUNEL法检测细胞凋亡：按试剂盒说明书操作。细胞核中出现棕褐色颗粒者为阳性细胞。

4 统计学处理

SPSS 21.0进行统计学分析，计量资料用均数±标准差(mean±SD)来表示，计数资料比较经正态分布检验，采用两组独立样本t检验分析。以P<0.05认为差异有统计学意义，病理形态学结果用对比描述方法分析。

结 果

1 各组大鼠血生化相关指标(ALT和AST)变化

第4周末，模型组和姜黄素组分别与正常对照组对比，大鼠血清ALT和AST均升高(P<0.05)。实验结束时，与正常对照组相比，模型组大鼠血清ALT和AST显著升高，姜黄素组大鼠血清ALT和AST与模型组比较显著降低(P<0.05)，见表1。

表1 肝功指标的变化

*P<0.05，**P<0.05vsnormal control group；#P<0.05，##P<0.05vsmodel group.

2 各组大鼠肝脏组织病理学变化

第4周末，模型组和姜黄素组大鼠较正常对照组肝细胞胞质内见脂肪滴，炎症细胞明显增多，结合生化指标结果，提示造模成功，见图1；第8周末，正常对照组大鼠肝小叶结构完整，肝索排列整齐，肝细胞大小、形态规则；模型组大鼠肝小叶边界模糊，肝索排列紊乱，可见炎症细胞浸润，肝细胞体积明显增大，胞质内可见大泡性脂肪滴；姜黄素组大鼠肝细胞脂肪变性及炎性程度均明显减轻，未见明显坏死灶，见图2。

Figure 1.Pathological results for rat liver at the end of the 4th week (HE staining). A: normal control group; B: model group. Red arrow: fat drop; black arrow: inflammatory cell infiltration.

图1 第4周末各组大鼠肝脏病理学结果

Figure 2.Pathological results for rat liver at the end of the 8th week (HE staining). A: normal control group; B: model group; C: curcumin group. Red arrow: fat drop; black arrow: inflammatory cell infiltration.

图2 第8周末各组大鼠肝脏病理学结果

3 各组大鼠肝组织相关蛋白表达

Western blot检测肝组织ERS相关蛋白GRP78和CHOP的表达，得到相应条带，可见：模型组较正常对照组GRP78和CHOP表达显著上调，姜黄素组较模型组CRP78和CHOP表达显著下调 (P<0.01)，见图3。

Figure 3. The expression levels of GRP78 and CHOP in liver tissues of rats in each group. Mean±SD.n=8.##P<0.01vsnormal control group;**P<0.05vsmodel group.

图3 各组大鼠CRP78和CHOP的表达变化

4 各组大鼠肝细胞凋亡情况

正常对照组大鼠肝细胞可见极少凋亡细胞，模型组凋亡细胞增多；姜黄素组大鼠的凋亡肝细胞较模型组减少，见图4。

讨 论

NASH的发病机制仍不十分明确，被广泛接受的是“二次打击”学说，即脂类在肝细胞沉积为第1次打击过程，由此引发的一系列细胞毒性反应为第2次打击[12-13]，进一步导致肝脏损伤。目前研究表明，NASH的发病过程是多因素共同作用的结果，过度的ERS能造成肝细胞功能失调，诱发肝细胞凋亡的发生[14]，而肝细胞凋亡可被游离脂肪酸诱导引起脂肪代谢紊乱并进一步诱发ERS，最终导致NASH的出现[15-17]。GRP78是位于内质网膜上辅助内质网中新生肽形成正确构象的蛋白，当内质网中未折叠及错误折叠蛋白蓄积增加时，GRP78蛋白与PERK分离[15]，表达上调，故被认为是ERS启动信号，这为临床判断肝细胞内质网的应激状态提供了思路，即检测GRP78蛋白表达水平高低[18]。CHOP存在于细胞质中，在ERS激活时而转至细胞核，通过下调抗凋亡基因Bcl-2以及上调促凋亡成员Bim的表达促进细胞凋亡，因此被认为是ERS最主要的凋亡因子。

本研究采用高脂饮食构建NASH模型，显示模型组ALT和AST高于正常对照组，并出现了肝细胞脂肪变性和炎症因子浸润，凋亡细胞明显增多，提示造模成功；而经姜黄素治疗后，肝细胞脂肪变性、炎症细胞浸润及肝细胞凋亡程度、以及肝功能(ALT和AST)均显著下降，提示姜黄素对NASH大鼠肝脏具有保护作用。姜黄素是从植物姜黄中提取的有效物质，国内外研究发现姜黄素具有抗炎、抗氧化应激、抗肿瘤和抗纤维化等药理作用[19]；姜黄素可减轻衣霉素诱导ERS引起的肝损伤[20]，同时能够清除自由基，防止脂质过氧化。随着临床对姜黄素的抗肿瘤作用的持续关注和深入，有研究指出姜黄素能够通过ERS途径诱导癌细胞的细胞周期阻滞和凋亡，抑制癌细胞活性[21]。姜黄素可通过CHOP途径抑制肝癌细胞增值，其增殖抑制作用与药物浓度及作用时间有关[22]。而本研究结果也证实模型组大鼠GRP78及CHOP蛋白的表达较正常对照组均增高，说明NASH大鼠肝细胞发生内质网应激并诱导产生肝细胞凋亡；姜黄素组大鼠GRP78和CHOP蛋白的表达降低。由此可见，姜黄素可通过下调GRP78和CHOP表达抑制ERS发生，从而减轻肝细胞凋亡，发挥保护肝脏的作用。

Figure 4.Results for hepatocyte apoptosis.A: normal control group; B: model group; C: curcumin group. Black arrow: apoptotic cells.

图4 肝细胞凋亡结果

综上所述，姜黄素能改善NASH大鼠肝功能、减轻其病理学改变、减轻肝细胞凋亡的生理作用可能与其抑制ERS有关，为临床应用姜黄素治疗NASH提供了依据。但因本研究样本量有限，需要扩大样本量进一步研究。