环状RNA的功能以及调控动脉粥样硬化发生发展的研究进展*

李 琦， 田江天， 田进伟， 李晓波△

(哈尔滨医科大学 1病理学教研室， 2附属第二医院心肌缺血教育部重点实验室， 黑龙江 哈尔滨 150000)

[中图分类号]R363; R543.5[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2019.11.027

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是由多种原因引起的心血管疾病，包括高血压、糖尿病、高血脂症和吸烟等。AS对人类有极大的危害，由AS引发的心血管疾病已对人类健康构成了严重威胁。AS的发生可引起血管壁损伤和炎症反应，其原因可能是血管平滑肌细胞和内皮细胞的凋亡、坏死以及巨噬细胞的分化等。近年来，许多研究发现环状RNA(circular RNA，circRNA)在AS的发生和发展中起着关键的调节作用。因此，本文对circRNA调控AS的最新研究进行了综述。

1 环状RNA概述

circRNA是一种特殊的非编码内源性RNA(non-coding endogenous RNA，neRNA)，利用高通量测序和生物信息学方法分析发现其大量存在于真核细胞转录组中。circRNA与线性RNA的主要区别是前者无5’端和3’端多聚腺苷酸尾，是由共价键形成的闭合环状RNA分子[1]。circRNA的这一特殊结构使其不易被核酸外切酶水解，所以比线性RNA更稳定，且具有进化保守性[2]。

1.1环状RNA的分类及产生机制 根据circRNA与邻近基因的基因组接近程度不同，可将其分为5类：(1)正义circRNA:分为外显子circRNA(exon circRNA，EciRNA)和外显子内含子环状RNA(exon-intron circRNA，EIciRNA),在同一链上由线性转录物的一个或多个外显子产生，其中EciRNA是分布最广泛的circRNA，近来，研究者们已经创建了一个能容纳多达32 000条人类EciRNA的综合数据库——circRNADb[3]；(2)内含子circRNA(intronic circRNA，IciRNA)：是完全来自线性转录物的一个内含子，在有义链或相对链中产生；(3)反义circRNA：是在相对链上重叠线性转录物的一个或多个外显子时产生的；(4)双向或基因内circRNA：从线性转录物的相同基因位点转录并且基因组接近1 kb以内，但并不是IciRNA；(5)基因间circRNA：位于2个基因之间的基因组区间，并且距离已知基因位点至少1 kb，见图1[4]。

Figure 1.Categories of circRNA.

图1 circRNA的分类

目前解释circRNA的形成有以下几种理论[5-7]：(1)套索驱动环化(lariat-driven circularization)，也被称作外显子跳读(exon skipping)：主要机制是前体mRNA(pre-mRNA)下游的外显子剪接供体(splice donor，SD)的3′端与pre-mRNA上游的外显子剪接受体(splice acceptor，SA)的5′端相连，可结合成套索结构，之后去除内含子，从而形成circRNA；(2)内含子配对驱动环化(intron-pairing-divern circularization)，也叫直接反向剪接(direct reverse splicing)：主要机制是pre-mRNA的内含子由碱基配对成环，将内含子去除或者保留，形成EciRNA或者ElciRNA；(3)内含子套索及剪接驱动环化(intron-lariat and splice-driven circularization)；(4)RNA结合蛋白驱动环化(RNA-binding protein-driven circularization)：RNA结合蛋白成对存在，使内含子彼此靠近，去除内含子形成circRNA。

1.2环状RNA的特性 与线性RNA相比，circRNA有一些独特的性质。(1)主要在细胞质内，很少在细胞核内；(2)大多数来自外显子，少数来自内含子[8]；(3)某些circRNA通过微反应元件与微小RNA(microRNA，miRNA)相互反应，进而调节目的分子的表达[9]；(4)circRNA存在于多种细胞的体液例如唾液、血液和尿液中，其表达量比相应线性RNA高10倍以上[10]；(5)circRNA具有很强的进化保守性[11]；(6)circRNA比较稳定，是由共价键形成的闭合环状RNA分子，这一特殊结构使其不易被核酸外切酶或RNaseR水解[12]，所以其生物功能更稳定；(7)circRNA在大多数生物中的平均半衰期比线性RNA长得多[13]。因此，circRNA可能具有某些特殊的生物学作用。

1.3环状RNA的生物学功能

1.3.1充当“miRNA海绵” circRNA是一种非编码RNA(nocoding RNA，ncRNA)，含有miRNA响应元件(miRNA response element，MRE)[14]，可作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)结合miRNA，抑制miRNA与细胞质中mRNA结合，调控基因表达，这种功能称为“miRNA海绵”[15]。研究发现，作为人类细胞生长调节剂的环状同源结构域相互作用蛋白激酶3(circular homeodomain-interacting protein kinase 3，circHIPK3)，可以作为miRNA的分子海绵，直接结合miR-124并抑制其表达[16]。Hall等[17]发现，来源于低密度脂蛋白受体相关蛋白6(low-density lipoprotein receptor-related protein 6，Lrp6)的circ-Lrp6，可以充当miR-145的海绵，上调miR-145的靶基因(ITGβ8、FASCIN、KLF4、Yes1和Lox)的表达；此外，在体内沉默circ-Lrp6，能够显著防止血管内膜增生，进而抑制AS等心血管疾病的发生。研究人员还发现，circRNA-0044073在动脉粥样硬化中上调并通过海绵机制抑制miR-107的表达，促进人血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells， VSMCs)和血管内皮细胞的增殖[18]。这些研究表明，circRNA作为miRNA的海绵是一种常见现象。

1.3.2调控基因转录 EciRNA主要分布在细胞质中，而EIciRNA和IciRNA主要分布在细胞核中[19]，因此EIciRNA和IciRNA可能参与基因的调控和表达。RNA-DNA双荧光原位杂交发现EIciRNA、U1小核核糖核蛋白(U1 small nuclear ribonucleoprotein，U1 snRNP)、聚合酶Ⅱ(polymerase Ⅱ，Pol Ⅱ)与宿主基因启动子之间存在多重相互作用[20]。IciRNA可与RNA Pol Ⅱ结合，促进亲本基因转录，同样，EIciRNA可以与宿主基因启动子区域的U1 snRNP结合，再与亲本基因启动子上的Pol Ⅱ反应，形成ElciRNA-U1snRNP-Pol Ⅱ复合体，聚集RNA Pol Ⅱ，提高亲本基因的转录效率[21]。这些研究进一步为通过RNA-RNA相互作用起作用的基因表达机制提供了新见解。

1.3.3蛋白质海绵 RNA结合蛋白(RNA-binding protein，RBP)由于具有识别和结合RNA区域的能力，在RNA动力学中起着不可或缺的作用。蛋白质吸附现象也可以在circRNA中看到。研究发现，叉头盒O3相关环状RNA(forkhead box O3 related circular RNA，circFoxo3)是一种肿瘤抑制因子，它在异常表达之后，可以与细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1(cyclin-dependent kinase inhibitor 1， p21)反应形成三元复合体，从而阻止细胞周期的发展[22]。另外，一些EciRNA可以破坏成熟mRNA的完整性，并且具有翻译起始密码子的作用，从而使mRNA不能产生蛋白质，致使产物的表达下降。这种现象被称为“基因陷阱”(mRNA traps)[23]。总之，circRNA可以作为蛋白质和核酸之间的桥梁，发挥某些生物学功能。

1.3.4其它生物学功能 circRNA还有一些其他的功能[24]，例如，选择性剪切作用，蛋白质翻译等，它的这些功能使其在AS的发生发展中发挥着重要的作用。

2 环状RNA调控动脉粥样硬化发生发展的生物学作用

2.1环状RNA调节血管平滑肌细胞的表型转换 VSMCs是血管的重要组成成分，其表型转换是AS发展过程中必不可少的一部分，VSMCs转变为合成表型是其增殖的首要条件。研究表明，VSMCs的高度增殖会形成AS斑块，在一定刺激下，会由收缩型转化为合成型，影响AS的发生发展[25]，因此表型能否有效控制是预防AS的关键措施之一。研究发现，过表达hsa_circ_0007422(circ-SATB2，来自SATB2基因)能够抑制SM22α的表达，而SM22α是收缩型VSMCs的标志物，并且过表达circ-SATB2促进VSMCs的增殖和迁移，抑制细胞凋亡[26]，可见circ-SATB2对VSMCs的影响至关重要。Yang等[27]发现敲减hsa_circ_0029589 (circCHFR，来自第12号染色体)可有效抑制VSMCs在体外的增殖和迁移，而且circCHFR还参与了VSMCs表型变化的调控。也有报道表明，沉默rno-circ_005717 (circDiaph3)可促进VSMCs转化为收缩型，并且抑制细胞增殖和迁移，促进细胞凋亡，而VSMCs的凋亡可以促进AS斑块破裂[28]。以上结果均表明circRNA可以调节VSMCs的表型转化，同时也为AS等心血管疾病的诊断和治疗提供了新的思路。

2.2环状RNA参与调节内皮细胞的功能 内皮细胞由一薄层扁平细胞组成，形成血管的内壁，呈多边形，它可以合成和分泌多种生物活性物质，保证血管的正常舒缩功能[29]。当内皮细胞受损时，内皮细胞的结构和功能会发生变化，从而导致AS等心血管疾病。有报道称，氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)的增加可以更严重地促进AS的发展[30]；研究人员发现hsa_circ_0003575在ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)中上调，并且沉默hsa_circ_0003575能促进ox-LDL诱导的HUVECs增殖和血管生成[31]，可见ox-LDL有可能通过改变环状RNA的表达来影响内皮细胞的功能，进而调节AS的发生发展。Boeckel等[32]发现，在缺氧条件下，内皮细胞中发现大量circRNA，其中在体外沉默环状RNA锌指蛋白292(circular zinc finger protein 292，cZNF292)能抑制新生血管萌发和内皮细胞增殖；同样，hsa_circ_0010729在缺氧诱导的HUVECs中表达增加，沉默hsa_circ_0010729能促进缺氧诱导的HUVECs增殖，抑制细胞凋亡[33]。这些结果表明，在缺氧条件下circRNA可以影响内皮细胞的功能，并进一步影响AS的发生发展。

2.3环状RNA参与调节巨噬细胞的功能 巨噬细胞是一类重要的免疫细胞，主要在单核细胞受到巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating fator，M-CSF)的作用下分化而成，巨噬细胞通过清道夫受体大量吞噬ox-LDL，继而转化为巨噬细胞源性泡沫细胞，同时，巨噬细胞释放细胞因子，胆固醇在巨噬细胞内积聚，巨噬细胞在病理状态下释放炎症因子，刺激细胞凋亡、坏死，随后形成AS斑块， 因此巨噬细胞在AS病理过程中发挥着重要的作用[34]。Wang等[35]发现，在THP-1衍生的巨噬细胞中过表达hsa_circ_0004104，能够上调AS易感基因(如IDO1、MMP8、CD40)，下调抗AS基因(如ApoAI、RNASE1)，加重AS的发病几率，而且hsa_circ_0004104参与先天免疫反应，细胞黏附和细胞迁移，对于预防以及防治AS至关重要。研究表明，沉默脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)诱导的circRNA——mcircRasGEF1B，可以减少LPS诱导的细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)的表达，保护巨噬细胞免受病原体的感染，继而减少炎症因子释放，减少斑块的形成[36]。这对于控制AS的发展至关重要。

2.4环状RNA作为动脉粥样硬化的潜在治疗靶点 AS对人类的危害极其严重，那么探究其潜在的治疗靶点对预防和治疗AS至关重要。Holdt等[37]发现，circANRIL通过控制核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)的成熟来调节AS形成，其机制为circANRIL与雌激素受体共调节因子PES1(pescadillo homologue 1)反应，破坏VSMCs和巨噬细胞中核酸外切酶介导的pre-rRNA的处理和核糖体的形成；而且circANRIL能诱导p53(一种肿瘤抑制因子)通路的激活，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖，增强抗AS的效应。实验表明，注射维生素D3和喂食高脂肪饮食共同构建的AS大鼠模型中，降低冠状动脉内皮细胞中circANRIL的表达，可以抑制细胞凋亡，防止炎症因子释放，预防冠状动脉粥样硬化[38]。以上结果表明，circANRIL能以控制rRNA成熟和调节内皮细胞的功能间接抑制AS形成，提示circANRIL可以作为治疗和诊断AS的潜在治疗靶点。Zhao等[39]对冠心病患者和对照者的外周血进行circRNA检测，发现hsa_circ_0124644的敏感度和特异度最高，具有生物标志物的诊断价值，并且其与冠心病存在相关性，提示此circRNA可参与冠心病的病理生理过程，可作为潜在生物标志物。

3 展望

近年来，circRNA已成为分子生物学研究中的一个新焦点。随着不断的研究，circRNA的生物功能以及在AS中的作用机制已逐渐被发现，这为诊断及治疗AS奠定了坚实的基础。但是，迄今为止研究者们对circRNA的研究还处在初步阶段，对于circRNA在AS后续的发生发展、患者预后以及在临床上的应用等，仍是我们未来需要不断探究的问题。但随着研究者们的不断努力以及科学技术的不断创新，相信在不久的将来，将会发现circRNA的更多功能以及与AS等心血管疾病相关的作用机制，这将为AS等心血管疾病的诊断及治疗提出新的见解和治疗靶标。