基于偏最小二乘回归法分析五味子抑菌活性部位谱效关系

卞振华，胡敏敏，袁晓航，刘 顺，费逸明∗

（1.南京中医药大学无锡附属医院，江苏 无锡214000；2.南京中医药大学附属医院，江苏 南京210000）

五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果实，习称北五味子，分布于黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北、山西、宁夏、甘肃、山东等地。其味酸、甘，性温，归肺、心、肾经，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心之功效。临床常用于久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗盗汗、津伤口渴、内热消渴以及心悸失眠等疾病［1-6］。本课题组前期研究表明，70%乙醇提取的五味子依次经石油醚（60～90 ℃）、三氯甲烷和乙酸乙酯分段萃取，乙酸乙酯萃取组分经AB-8大孔吸附树脂分离水洗脱，得到抗MRSA 体外抑菌活性组分（EEW），同时对抗生素敏感金黄色葡萄球菌和临床分离的耐药MRSA 均具有较强的抑菌活性［7］。本实验采用偏最小二乘回归分析法，对五味子抗MRSA 体外抑菌活性组分的UPLC-MS 特征指纹图谱与体外抑菌活性药效进行相关性分析，以期筛选出五味子抗MRSA 主要抑菌活性成分（群），初步揭示五味子抑菌活性的药效物质基础。

1 材料

1.1 试药 五味子（9批药材产地及采收时间见表1）经无锡市中医医院胡敏敏副主任中药师鉴定为木兰科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果实，标本（编号YXB20161101～YXB20161109）保存于中药研究室；万古霉素（西班牙Lilly 公司，批号C752996）；柠檬酸（中国食品药品检定研究院，批号111679-201602）。

表1 样品信息

乙腈（色谱纯，美国Fisher Scientific 公司）；甲酸（色谱纯，美 国Sigma-Aldrich 公 司）；水（超纯水，美 国Millipore 公司）；AB-8大孔吸附树脂（天津市光复精细化工研究所）；其他试剂均为分析纯。MH 琼脂培养基（批号3105584，广东环凯微生物科技有限公司）；MH 肉汤培养基（批号3105299，广东环凯微生物科技有限公司）；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC 43300（批号20160510，广东省微生物菌种保藏中心）。

1.2 仪器 Acquity UPLC 超高效液相色谱仪、Maldi synapt QTOF-MS 四级杆飞行时间质谱（英国Waters 公司）；SHP-100型生化培养箱（常州普天仪器制造有限公司）；BSC-1300型生物安全柜（上海上净净化设备有限公司）；WGZ-2XJ 型细菌浊度仪（北京鑫骉腾达仪器设备有限公司）；RE52CS 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；BSA224SCW 电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）。

2 方法

2.1 五味子抗MRSA 体外抑菌活性组分制备 称取经65 ℃干燥后粉碎的五味子药材10 g，料液比为1 ∶10加入70%乙醇回流提取3 h，80 ℃提取2次，合并2次提取液，旋蒸浓缩至干，得五味子乙醇提取物浸膏。加纯化水100 mL 混悬，分别依次用等体积石油醚（60～90 ℃）、氯仿、乙酸乙酯各萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，浓缩至干得到乙酸乙酯萃取物。乙酸乙酯萃取物混悬于纯化水中，配制成10 g／L 的上样液，上预处理过的AB-8大孔吸附树脂，大孔树脂用量60 g，料液比3 ∶1，上样体积流量2 mL／min，静置吸附3 h，用3倍柱体积的纯化水洗脱，洗脱体积流量4 mL／min。收集纯化水洗脱组分，浓缩至干，真空干燥得到AB-8大孔吸附树脂分离五味子乙酸乙酯萃取物纯化水洗脱组分（抗MRSA 体外抑菌活性组分）。

2.2 抗MRSA 活性组分抑菌药效测定

2.2.1 菌悬液制备 选取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC 43300单个典型菌落于MH 肉汤培养基37 ℃培养24 h，用浊度仪校正菌悬液至0.1麦氏比浊单位，含菌量为3×107CFU／mL 备用［8］。

2.2.2 抗MRSA 体外抑菌活性药效学测定 按2015年版《中国药典》 推荐的管碟法测定体外抑菌活性，取直径90 mm 培养皿，加入融化的MH 琼脂培养基20 mL，均匀摊布，放置冷却凝固，作为底层。另取MH 琼脂培养基加热融化后冷却至50 ℃，加入“2.2.1”项下实验菌悬液，使含菌量为1.0%，摇匀后加5 mL 至培养皿中，在底层上均匀摊布，作为菌层。放置冷却凝固后，在菌层上等距离均匀放置不锈钢小管［内径（6.0±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm，外径（7.8±0.1）mm］4个［9］。取9批五味子药材，按“2.1”项下方法制备9批五味子抗MRSA 体外抑菌活性组分供试品，精密称取，加无菌水配制成100 g／L 供试品溶液。向每个不锈钢小管加入0.1 mL 供试品溶液。每个供试品溶液测试单独重复3次，培养皿置于生化培养箱37 ℃下培养24 h，游标卡尺测量抑菌圈直径，测出9批五味子抗MRSA 体外抑菌活性组分供试品溶液抑菌圈直径平均值。分别在各皿中加入万古霉素阳性对照组，向不锈钢小管中加入质量浓度为10 g／L 的万古霉素0.1 mL。设阴性对照组，向不锈钢小管中加0.1 mL 的无菌水溶液。根据抑菌系数判断各组分对细菌的敏感性，抑菌系数越大表明抑菌活性越强［10］。

2.3 UPLC-MS 特征指纹图谱建立

2.3.1 供试品溶液制备 取“2.2.2”项下供试品溶液，精密称取0.005 0 g，2 mL 甲醇溶解，进样前经0.22 μm 微孔滤膜过滤。

2.3.2 色谱条件 色谱柱Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脱，洗脱程序（0～3 min，0%A；3～10 min，0%～15%A；10～12 min，15%～80% A；12～12.1 min，80%～0%A）；体积流量0.3 mL／min；柱温45 ℃；进样量2 μL。

2.3.3 质谱条件 电喷雾电离离子源（ESI），负离子模式扫描质谱响应更强，毛细管电压3.0 kV，锥孔电压30 V，离子源温度100 ℃，脱溶剂气温度400 ℃，锥孔气流量50 L／h，脱溶剂气流量700 L／h。低能量扫描传输碰撞能量6 eV，高能量扫描传输碰撞能量20 eV，扫描质量范围为m／z20～1 000。

3 结果

3.1 抗MRSA 体外抑菌活性组分收率 按“2.1”项下方法制备9批五味子药材乙酸乙酯萃取物分别为0.291 2、0.321 5、0.334 5、0.323 5、0.345 7、0.326 7、0.341 2、0.308 9、0.324 3 g，收率分别为 2.912%、3.215%、3.345%、3.235%、3.457%、3.267%、3.412%、3.089%、3.243%。9批五味子药材抗MRSA 体外抑菌活性组分分别为0.197 3、0.200 7、0.223 4、0.228 3、0.232 4、0.228 9、0.232 3、0.208 7、0.213 4 g，收率分别为1.973%、2.007%、2.234%、2.283%、2.324%、2.289%、2.323%、2.087%、2.134%。

3.2 抗MRSA 活性部位抑菌活性检测结果 根据抑菌系数（抑菌系数=供试液的抑菌圈直径／同一培养皿中万古霉素的抑菌圈直径），判断各批次组分对MRSA 的敏感性。见表2，与阴性对照组（抑菌圈直径为7.80 mm，即没有产生抑菌作用）相比，9批五味子抗MRSA 体外抑菌活性组分均具有一定的抗MRSA 活性，都有极显著性差异（P＜0.01），其中S2的抗MRSA 抑菌活性最强。

表2 9批样品抗MRSA 体外抑菌活性组分抗MRSA 抑菌活性（， n=3）

表2 9批样品抗MRSA 体外抑菌活性组分抗MRSA 抑菌活性（， n=3）

注：与阴性对照组比较，∗∗P＜0.01

3.3 UPLC-MS 特征指纹图谱分析 对9批五味子抗MRSA体外抑菌活性组分运用MassLynx V4.1对负离子模式总离子流图分析处理，UPLC-MS 特征指纹图谱见图1。运用Integrate chromatogram 软件自动积分，分别导出特征图谱中的各峰面积，根据各样品特征指纹图谱的各峰保留时间，共匹配出11个共有峰，见表3。

图1 9批样品抗MRSA 体外抑菌活性组分UPLC-MS 特征指纹图谱

表3 不同产地样品抗MRSA 体外抑菌活性组分共有峰峰面积

3.4 谱效关系分析

3.4.1 偏最小二乘回归方程建立 以特征指纹图谱中代表化学成分各峰的峰面积为自变量X，五味子抗MRSA 活性部位的抑菌系数为因变量Y，采用SIMCA-P 14.1软件对其进行偏最小二乘回归分析，数据选择标准差标准化处理，消除变量量纲差异，得回归方程Y=-0.486 7X1＋0.224X2＋0.503 6X3-0.104X4-0.411 7X5-0.12X6-0.743 6X7-0.257 8X8＋0.632 2X9＋0.750 6X10＋0.140 1X11-0.439 3X12，其中回归系数代表各自变量对药效的贡献大小，回归系数越大对药效贡献越大，并且系数正值自变量与药效正相关，负值与药效负相关，偏最小二乘回归模型回归系数见图2。模型诊断参数R2X=0.967，R2Y=0.998，Q2=0.713，表明该回归模型具有较强的拟合解释能力和模型预测能力［11］。

图2 五味子抑菌谱效关系偏最小二乘回归系数

3.4.2 变量重要性分析 在偏最小二乘回归分析中，变量重要性反映了自变量X对因变量Y的解释能力大小，变量重要性值越大，自变量X的解释能力越强。结果见图3。偏最小二乘回归模型采用回归系数和变量重要性值综合评价各特征共有峰对抑菌活性的贡献大小，按照各特征峰的回归系数表明X2、X3、X9、X10、X11与抑菌活性呈正相关，且X2、X3、X9、X10、X11的变量重要性值均较大，在解释因变量Y时具有显著的重要性［12］。综合评价各特征峰的贡献小大排序为X10＞X9＞X3＞X2＞X11。因此，可认为峰10、9、3、2、11在UPLC-MS 特征图谱上代表的化合物为五味子抗MRSA 抑菌活性物质（群），且抑菌活性贡献由大到小依次排列。经分子式匹配软件Elemental compositionTM计算处理，结合各化合物相对分子质量和相对保留时间，经过文献检索和相关数据库对各主要分子离子峰以及高能量碰撞碎片信号进行归属，对特征峰2、3进行UPLC-MS／MS化合物定性鉴别。初步鉴定结果峰2为柠檬酸，峰3苹果酸异构体，化合物鉴定结果见表4。

表4 化合物成分鉴定结果

4 讨论

偏最小二乘回归分析具有不受数据多重相关性影响，可用于样本数小于变量个数的数据分析，不需要像多变量相关性分析中的向前、向后以及逐步回归法去除不显著变量，是一种模型拟合度好和预测能力强的数据处理方法［13］。不同产地批号的五味子有着不同的抑菌活性，根本原因是含有抑菌活性成分（群）的质和量的差异。本实验利用UPLC-MS 特征图谱来呈现这种质和量上的差异，采用偏最小二乘回归分析对五味子抗MRSA 抑菌活性组分UPLC-MS 特征图谱共有峰与药效相关性研究，建立回归模型，分析得到五味子中5种成分抗MRSA 抑菌活性贡献较大，进一步揭示了五味子抑菌活性药效物质基础为多个活性成分。通过UPLC-MS／MS 初步鉴定了2个贡献较大的化合物，均为大极性有机酸，在后续的研究中利用色谱等相关分离技术以期得到化合物单体，进一步鉴定化合物成分，验证化合物的抑菌活性。