云贵川湖泊芽孢杆菌分离、鉴定及抗动物病原菌活性研究

张君利，刘超兰，郭义东，林家富

(成都大学四川抗菌素工业研究所，抗生素研究与再评价四川省重点实验室，成都610052)

近年来，由于畜禽行业抗生素的过度使用，细菌耐药性不断增强，使中国成为世界上动物源性细菌耐药性最严重的国家之一(胡燕等，2013)。临床分离的畜禽常见病原菌(大肠杆菌Escherichiacoli、金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus、巴氏杆菌Pasteurella、沙门氏菌Salmonella、肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae、铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa等)可耐受抗菌药物达5～20种，引起了人们对动物疾病防治的高度重视。与此同时，60%以上的人体病原菌来自动物。一些人畜共患病原菌特别是食源性病原菌的出现，也对我国的动物源食品安全和公众健康构成了严重威胁(Theuretzbacher，2013)。原有病原菌抗耐药情况还未缓和，新病原菌抗耐药又不断出现，促使人类寻找新型抗生素和抗菌药物(Olga，2017)。目前已有的生物活性物质基本是从土壤放线菌中获得的(谭悠久等，2011)。但是，由于陆地资源的过饱和挖掘，使得发现更多新化合物和新菌种越来越难。因此，人们开始把海洋、湖泊、极端环境、植物内生等作为新的研究对象，以期利用新的生长环境获得新的微生物资源，提高新化合物及活性化合物的发现几率。

本课题组前期从云贵川地区的9个湖泊沉积物中分离出244株菌，鉴定为变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteria、厚壁菌门Firmicutes以及异常球菌-栖热菌门Deinococcus-Thermus 4个门，芽孢杆菌属Bacillus、链霉菌属Streptomyces和库特氏菌属Kurthia等24属。经过菌株的活性初筛，发现芽孢杆菌属活性较好。因此，本文将从湖泊沉积物芽孢杆菌的分离、鉴定及抗动物病原菌活性评价等方面进行阐述，为利用湖泊来源的芽孢杆菌及其脂肽类抑菌物质、进一步开发抗动物病原菌的新型微生物药物提供菌种资源和理论依据。

1 材料与仪器

1.1 样品来源

对云贵川地区的9个湖泊进行深度采样，每个湖泊采集1份水体沉积物样品(表1)，密闭的50 mL离心管保存于冰盒，72 h内送至实验室培养。

1.2 主要仪器和试剂

PCR扩增仪(Bio-Rad，美国)；LDZM-80KCS立式压力蒸汽灭菌器(申安，上海)；ZF-20D暗箱式紫外分析仪(远怀，上海)；超净工作台(安泰，苏州)；电子生化培养箱(东联，哈尔滨)；1200系列液相色谱-质谱联用仪(Agilen，美国)；LC-20AD液相色谱仪(岛津，日本)；实验室其他常规仪器。

TIANGEN酵母基因组DNA提取试剂盒；2×TSINGKE Master Mix，10×Loading Buffer；DL2000DNA Maker；标准品98%surfactin，90%iturin(Sigma)；其他试剂均为分析纯。

表1 样品信息Table 1 Sampling information

1.3 培养基

分离培养基：LB琼脂培养基和海洋(2216E)培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司；发酵培养基：LB肉汤培养基；动物病原菌培养基：LB琼脂培养基和马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.4 动物病原菌

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌Candidaalbicans均由四川抗菌素工业研究所菌保中心提供。

2 实验方法

2.1 菌株分离纯化

使用稀释涂布法分离菌株：首先将沉积物样品放置于超净工作台，过夜风干，称取2 g，加入18 mL灭菌蒸馏水，震荡2 h。其次将混悬液梯度稀释至10-1～10-6，分别取100 μL悬浊液均匀涂布于营养琼脂平板，37 ℃培养48 h。根据菌落质地、大小、颜色和光泽等特征，挑取形态差异明显的单菌落。最后重复2～3次，镜检，将已纯化的菌株于25%甘油中-80 ℃保存。

2.1.1 形态特征菌株在37 ℃的LB培养基中生长48 h后，将细菌细胞悬浮在0.85%(w/v)的NaCl溶液中，在镀镍网上加热干燥，并用磷钨酸染色，使用电子显微镜观察细胞的大小和形态；通过悬滴法(Bowman，2000)检测细胞的运动能力；通过革兰氏染色法(Smibert，1994)鉴别菌株。

2.1.2 生理生化特征温度：将实验菌株接种到LB固体培养基，在不同的温度(4～50 ℃，间隔5 ℃)下培养，此外，在28 ℃和37 ℃培养菌株，确定最适生长温度和范围。pH：将30 ℃条件下培养好的菌株接种到不同pH值(pH=5～11，间隔0.5)的LB液体培养基中培养3～5 d，观察菌株的生长情况，测定菌株在OD600时的吸光度，以确定最适生长pH及范围。盐度耐受：在LB固体培养基上分别添加不同浓度的NaCl(范围0～10%，间隔1%)(w/v)检测菌株对NaCl的耐受程度。酶学特征：过氧化氢酶活性、氧化酶活性测定参考Cui等(2001)的方法。吲哚、明胶、七叶苷的实验均参考细菌系统鉴定手册。

2.2 菌株16S rRNA基因序列测定及系统发育分析

通过DNA试剂盒提取基因组DNA。采用 20 μL反应体系进行PCR扩增，即DNA模板2 μL，2×TSINGKE Master Mix 10 μL，27F(10 μmol·L-1)1 μL，1492R(10 μmol·L-1)1 μL，超纯水6 μL。27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)为细菌通用引物。PCR扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，通过Bio-Rad凝胶成像仪观察电泳结果。

PCR扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，将所得各菌株16SrRNA基因序列通过NCBI数据库进行Blast比对，以相似性较高的标准菌株的16SrRNA序列作为参照对象进行种属菌属分类。根据菌株比对结果，采用MEGA 7.0(Kumaretal.，2016)以邻接法(Neighbor-Joining)(Saitou &Nei，1987)构建系统发育树。分析各湖泊之间的菌种分布以了解不同环境之间、不同种之间、环境与种之间的关系。

2.3 菌株发酵及抗菌活性检测

用接种环挑取斜面培养基上已纯化菌株的适量菌体接种于装有40 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，置于30 ℃、200 r·min-1的摇床培养2～3 d。离心取上清，加浓盐酸调至pH2，沉淀过夜。12 000 r·min-1、30 min，离心去上清，向沉淀中加入2 mL甲醇溶解，最后过0.22 μm微孔滤膜，将甲醇浸提液通过减压浓缩至蒸干，然后称重，并将粗提物用甲醇再次溶解配置成10 mg·mL-1的母液备用。使用动物病原菌进行抗菌活性检测。

采用滤纸片抑菌圈法对菌株进行抗菌活性检测。分别将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌接种于LB液体培养基中，白色念珠菌接种于PDA液体培养基中，置于37 ℃、180 r·min-1的摇床上培养18 h，获得种子液。在超净工作台中，分别吸取100 μL种子液加入到45 ℃左右的100 mL的LB琼脂培养基和PDA培养基中，摇匀后倒平板。待平板凝固后，分别将含有约10 μL粗提物母液的灭菌滤纸片(直径8 mm)以合适的间距放置于平板上，每组设置3个平行试验。于37 ℃培养24 h，同等条件下设置空白对照，观察有无透明圈并记录大小。

2.4 活性菌株次级代谢产物的LC-MS分析

对粗提物和配制成1 mg·mL-1的标准品进行LC-MS检测，参照标准品对次级代谢产物的活性成分进行分析。液相色谱条件为C18-MS-Ⅱ(2.6 mmφ×250 mm，TSK)；进样量20 μL；柱温25 ℃；流动相为(A)乙腈和(B)水。洗脱条件为：0～10 min，A 20%～50%，B 80%～50%；10～50 min，A 50%～65%，B 50%～35%；50～60 min，A 50%～65%，B 50%～35%；流速0.6 mL·min-1。紫外检测波长为210 nm。

质谱条件为：ESI电喷雾；正离子模式；雾化气压力1.0×105Pa；毛细管电压3 500 V；氮气干燥，流速为10 L·min-1，250 ℃；扫描范围300～1 800 m/z。

3 结果及分析

3.1 菌株分离鉴定

菌株的表型特征显示，芽孢杆菌是一种短杆状、无荚膜、能运动的革兰氏阳性细菌，菌落呈光滑圆形、不透明、乳白色。生理生化特征显示其在pH为6～8，温度为25～37 ℃，NaCl浓度为0～5%的培养条件下生长良好，属于严格好氧或兼性厌氧菌；细胞大小为0.3～2.2 μm×2.1～7.0 μm。其中，多数菌株的VP显示阳性；氧化酶和过氧化氢酶呈阳性；七叶苷、明胶水解，不产生吲哚(表2、表3)。

表2 菌株的表型特征Table 2 Phenotypic characteristics of strains

3.2 菌株16S rRNA基因序列测定及系统发育分析

3.2.116SrRNA测序分类使用上述处理方法根据菌落表型特征和16S rRNA鉴定，共分离得到47株芽孢杆菌，有26种，最多的为漳州芽孢杆菌Bacilluszhangzhouensis(7株)，食丁酸芽孢杆菌Bacillusbutanolivorans和海口芽孢杆菌Bacillushaikouensis各4株，高地芽孢杆菌Bacillusaltitudinis3株，其余各种为2株或1株(表4)。

3.2.2 系统发育分析47株芽孢杆菌自聚类分析(图1)显示，首先，各湖泊沉积物样品中所分离出的菌株分别聚为一簇，说明同一环境中的菌株之间亲缘关系相近；而不同地区的菌株大不相同，说明地区之间可能由于气候和经纬度差异，造成微生物种群差异。其次，菌株SIIA-Z556、SIIA-Z842、SIIA-Z530、SIIA-Z537和SIIA-Z531均来自邛海，且聚为一簇，可靠度达78%，同源性较高。菌株SIIA-Z858、SIIA-Z656、SIIA-Z665和SIIA-Z573均来自泸沽湖，且聚为一簇，可靠度高达100%，同源性非常高，进化关系极为相近，说明同一生境更易产生亲缘关系相近的菌种。最后，来自洱海的菌株SIIA-Z536、来自红枫湖的SIIA-Z582与邛海分离出的菌株SIIA-Z556、SIIA-Z842、SIIA-Z537、SIIA-Z530、SIIA-Z531均属漳州芽孢杆菌，说明不同环境可以产生相同菌种。可见湖泊生境对于微生物多样性研究有着重要意义。

表3 菌株的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strains

3.3 发酵产物对病原菌的活性研究

采用琼脂扩散法对47株菌株发酵粗提物进行抗菌活性筛选(表5)。结果显示，共13株发酵粗提物对动物病原菌显示出抗菌活性。其中，对金黄色葡萄球菌显示出抗菌活性的菌株较多，有10株，对白色念珠菌有抗菌活性的5株，对大肠杆菌有抗菌活性的4株，而对铜绿假单胞菌显示出抗菌活性的仅2株。为明确活性化合物种类，将进一步对活性菌株的发酵粗提物进行LC-MS分析。

3.4 活性菌株代谢产物的LC-MS分析

对13株有抗菌活性菌株的发酵粗提物进行LC-MS分析，结果表明，芽孢杆菌所产生活性化合物主要为脂肽类。通过LC-MS检测到4种不同的质谱峰，各活性特征峰的分子量及根据质荷比推断产物归属类别如表6所示。发酵粗提物中，检测到surfactins质子峰的芽孢杆菌9株，均为C13～C15的surfactins质子峰，m/z=1 007.9、1 023.4和1 037.7，为相差1个亚甲基(-CH2-)的同系物；检测到fengycins质子峰的芽孢杆菌5株，均为C15、C16的fengycins质子峰，m/z=1 449.3和1 464.9，也为相差1个亚甲基(-CH2-)的同系物；检测到iturins质子峰的芽孢杆菌6株，其中，bacillomycin L质子峰4株，bacillomycin D质子峰2株。分析发现，有14株产表面活性素类抗菌脂肽的芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌或大肠杆菌有抑菌活性，有2株产丰原素类抗菌脂肽的芽孢杆菌对铜绿假单胞菌有抑菌活性，有5株产伊枯草素类抗菌脂肽的芽孢杆菌对白色念珠菌有抑菌活性。

表4 湖泊沉积物中分离的芽孢杆菌种类Table 4 Species of Bacillus isolates from different lake sediments

4 讨论

芽孢杆菌可产生多种抗菌物质，其中大部分为脂肽类化合物，脂肽属于非核糖体肽，而非核糖体肽是当前的研究热点。目前，我国对抗菌脂肽的研究还不够深入，即使在发达国家，也是一个新的领域。国内外对芽孢杆菌脂肽类化合物的研究大部分集中在抗真菌，尤其是抗植物病原真菌，只有少部分研究集中在抗细菌(李红亚等，2017)，对抗动物病原菌的研究则更鲜有。

据报道，芽孢杆菌产生的脂肽类化合物有表面活性素家簇、伊枯草素家簇和丰原素家簇(Tsugeetal.，2001；Koumoutsietal.，2004；Moyneetal.，2004；Chenetal.，2006)。其中，iturins和fengycins作为农业生产中常见植物真菌疾病的生物防治药(Romeroetal.，2004，2007；Luoetal.，2015)。Surfactins主要对细菌产生抑制作用(罗楚平等，2011；Zeriouhetal.，2011；Gordillo &Maldonado，2012；Meena &Kanwar，2015)。近年来，由于动物病原菌抗耐药情况的日益严重，人们开始尝试将芽孢杆菌脂肽类化合物用于动物病原菌的防治，效果显著。已有研究表明，在畜禽生产中芽孢杆菌具有调节动物肠道菌群平衡、抑制动物病原菌、防治消化道疾病以及提高机体免疫力等作用(李红亚等，2017)。在西方国家芽孢杆菌已被应用于人的功能性食品和动物饲料添加剂(叶小兰，杨倩，2011)。与细菌素等抗菌物质相比，芽孢杆菌所产生的抗菌脂肽杀菌范围更广、效率更高、毒副作用更小、稳定性更好。此外，抗菌脂肽对血凝、病毒和肿瘤也有很好的抗性。综上所述，由芽孢杆菌生产的脂肽类抗生素在农业、医药以及化妆品行业都具有巨大的应用前景(Aarrebolaetal.，2010)。

图1 菌株基于16S rRNA基因序列分析构建的系统发育树Fig.1 Phylogenetic dendrogram constructed based on 16S rRNA gene sequences

国内外大多从土壤环境中分离产抗菌脂肽的芽孢杆菌，且研究对象多为单一菌株。本研究从湖泊沉积物中分离出47株芽孢杆菌，以4株常见动物病原菌为检定菌进行活性检测，筛选出13株活性菌株，LC-MS技术对13株芽孢杆菌发酵产物的分析显示，有3种脂肽类抗生素，分别为表面活性素、伊枯草素和丰原素。活性检测表明，脂肽类抗生素对动物病原菌有显著的抗菌活性。本研究为丰富特殊生境中芽孢杆菌资源在畜禽疾病控制方面的研究提供了新的菌种资源。

表5 芽孢杆菌次级代谢产物对动物病原菌的抗菌活性Table 5 Antimicrobial activity of Bacillus submetabolites against animal pathogens

注：+有抑菌活性，-无抑菌活性
Notes：+bacteriostatic activity，-no bacteriostatic activity

表6 活性芽孢杆菌菌株的LC-MS分析Table 6 LC-MS analysis of active Bacillus strains