西北传统食品中乳酸菌的分离及提高免疫力菌株的筛选

陈丽娥，孙盛，俞赟霞，李理，陈彩玲，翁璐溦，任学良，郑志瑶，陈苏

(杭州娃哈哈集团有限公司杭州娃哈哈科技有限公司浙江省食品生物工程重点实验室，杭州310018）

0 引 言

中国西北地区地域辽阔，气候独特，拥有丰富且历史悠久的传统食品。这其中有一些特性优良的乳酸菌被保留了下来。乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一类能发酵乳糖而产生大量乳酸的细菌的通称。乳酸菌与人类的关系十分密切，不仅是人体消化道中的重要有益微生物群，还被广泛应用于食品工业、饲料发酵、医疗保健、禽畜的疾病防治等各个方面[1]。“通过摄入足够数量，对宿主起有益健康作用的活的微生物”[2]被定义为“益生菌”。益生菌主要包括3类：乳酸菌类，真菌类（酵母和霉菌）和芽孢菌类[3]。

益生菌在人体健康的很多方面都有作用，例如肠道健康[4]、精神健康[5]、免疫健康[6]等。人体的免疫系统在抵御外来有害物质的入侵方面发挥着重要的作用。益生菌在提高和调节免疫力方面的研究被广泛关注[7-8]。He F等人发现鼠李糖乳杆菌LGG增加小鼠肠黏膜IgA的分泌量，阻止病原菌感染上皮细胞，增强小鼠免疫力[9]。Raj Kumar Duary等人通过两株植物乳杆菌Lp9和Lp91在LPS诱导的HT-29细胞中分泌促炎和抗炎细胞因子的研究，发现这两株菌有免疫调节的功能[10]。Jang SE等人发现在免疫低下小鼠模型中，干酪乳杆菌HY7213可提高NK细胞活性，还可提高抗肿瘤细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌量，从而增加对致病菌的免疫反应[11]。

本文从新疆、西藏、青海、四川等地采集到的酸奶、奶酪、泡菜、青稞酒等样品中进行乳酸菌的分离、纯化和保藏。对分离到的乳酸菌进行提高免疫力功能的菌株筛选，包括体外细胞实验和造模免疫力低下动物实验的筛选，最终获得一株具有提高免疫力功能的发酵乳杆菌。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与耗材

MRS培养基（OXOID公司），M 17培养基（BD公司），Elliker培养基（实验室自配制），细菌基因组DNA提取试剂盒（上海生工生物有限公司），PCR扩增试剂，无菌Hank’s液，10%胎牛血清，RPMI-1640培养基，台盼蓝，Con A，DMSO，IL-10和IL-12测定试剂盒（BD公司），96孔细胞培养板，细胞培养瓶，环磷酰胺（上海源叶生物科技有限公司），盐酸左旋咪唑(Solarbio)，印度墨汁，Na2CO3，PBS，中性红，YAC-1细胞，乳酸锂，硝基氯化四氮唑（INT），吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS），NAD，0.2 mol/L的Tris-HCl缓冲液（p H 8.2），盐酸。

SPF级BALB/C小鼠140只，6～8周龄，18～22 g，许可证号码：SCXK（沪2017-0005），采购自上海斯莱克实验动物有限公司。

1.1.2 仪器

SG403A-HE-INT超净工作台（BAKER），BX 50荧光显微镜（OLYMPUS），恒温金属浴（杭州博日科技有限公司），Basic电泳仪（BIO-RAD），Gel DOCTM XR+凝胶成像仪（BIO-RAD），Mastercy PCR仪（eppendorf），Model 680酶标仪（BIO-RAD），HV-110全自动高压蒸汽灭菌锅（SANYO），5810R/5430R/5417R离心机（eppendorf），KB400恒温培养箱（BINDER），Galaxy 170S二氧化碳培养箱（eppendorf），DMI3000B倒置荧光显微镜（Leica）。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分离与保藏

适量的原始样品（采集自新疆、西藏、贵州、云南、青海等地）加入到适当体积的无菌生理盐水中,匀浆混匀后，生理盐水10倍梯度稀释，取适当的稀释梯度涂布在对应的培养基（MRS、M 17、Elliker培养基）上，于相应的培养条件培养48 h；从平板上挑取单菌落，在对应的平板上进行划线分纯（一般需要至少划线3代）。将革兰氏染色阳性且镜检形态一致的菌落接种至相应的液体培养基中培养，培养液离心去上清，加入30%无菌甘油，分装至冻存管，置于-80℃冰箱保存。

1.2.2 乳酸菌的分子鉴定

培养液离心去上清，按照细菌基因组DNA提取试剂盒的步骤抽提DNA。以基因组DNA为模板，27F（5'-AGTCTCTGATCATGC-3'）和1492R（5'-AAGGAGGTGCTCCAGCC-3'）为正反向引物进行16SrDNA片段的扩增。扩增产物在上海生工生物有限公司测序。测序结果通过NCBI-BLAST数据库比对。

1.2.3 乳酸菌的体外细胞筛选

（1）体外脾淋巴细胞增殖。

脾淋巴细胞增殖实验，参考Park JH和HSGill等人的方法[12-13]，简单描述如下：处死小鼠，无菌取脾脏，用眼科剪将脾脏剪碎后，用无菌的玻璃注射器芯将其碾碎，经200目金属筛网过滤后，加入含10%胎牛血清的无菌Hank’s液，1 000 r/min，4℃离心5 min，收获细胞。加入5倍于细胞体积的细胞裂解液，裂解5 min，加入含10%胎牛血清的无菌Hank’s液终止裂解，1 000 r/min，4℃离心5 min去上清。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基洗涤，1 000 r/min，4℃离心5 min。洗涤两次，沉淀重悬于5 mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基。细胞计数，调整细胞浓度为5×106cells/mL。乳酸菌活化菌液4 000 r/min室温下离心10 min去上清，PBS洗涤两次，加入适量含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，调整其OD600至0.50±0.10。将细胞悬液加入96孔细胞培养板，每个样品3个平行。设置调零组（细胞培养基），空白对照组（细胞悬液+细胞培养基，诱导剂组（细胞悬液+10μg/mL Con A），乳酸菌组（细胞悬液+10μg/mL Con A+菌悬液），置二氧化碳培养箱37℃培养72 h。每孔加入20μL MTT溶液（2.5 mg/mL），37℃显色4 h后，1 500 r/min，4℃离心10 min，吸出上清，再加入100μL DMSO，用酶标仪于490 nm下测定吸光值。

（2）脾淋巴细胞细胞因子检测。

脾淋巴细胞细胞因子检测，参考C Ai和T Jiang等人的方法[14-15]。细胞取材、红细胞裂解、洗涤、细胞计数、益生菌培养同1.2.3.1。将细胞悬液加入96孔细胞培养板，每个处理5个重复，分为调零组（细胞培养基100μL），空白对照组（1×107cells/ml的细胞悬液100μL，细胞培养基100μL），益生菌组（1×107cells/mL的细胞悬液100μL，1×108cfu/mL菌悬液100μL），37℃ 5%CO2培养箱中培养24 h。1 500 r/min离心10 min，吸取上清，0.22μm滤膜过滤，采用BD试剂盒测定IL-10和IL-12含量。

1.2.4 乳酸菌的免疫低下动物模型筛选

1.2.4.1 分组与给药方法

本实验采取随机分组设计，将近交系BALB/C雄性小鼠140只，适应期5 d，随机分为7组（空白对照组、模型组、阳性对照组和4个菌株组各20只）。动物饲养保持环境温度为21±2℃，湿度为30%～70%，12 h光照交替，自由饮水，自由摄入饲料。每三天换一次垫料，及时添加饲料和水。

采用免疫功能低下模型动物进行试验。阳性对照组每天灌胃40 mg／kg盐酸左旋咪唑，4个菌株组每天每只小鼠灌胃0.2 mL菌悬液（1×109CFU/mL），空白对照组和模型组给予等量无菌生理盐水。连续灌胃30 d，在第3周后开始除空白对照组外其余各组小鼠腹腔注射免疫抑制剂环磷酰胺（40 mg／kg，连续两天）。

1.2.4.2 检测指标与方法

（1）脏器指数。

小鼠称重。处死小鼠后无菌条件下取脾脏和胸腺，分别称重，计算脏器比(mg/g)。

（2）脾淋巴细胞增殖反应。

细胞取材、红细胞裂解、洗涤、细胞计数同体外脾淋巴细胞增殖实验。调整脾细胞浓度为3×106个/mL。将100 uL细胞悬液加入已加20 uL ConA液96孔培养板中，不加细胞的ConA液作为对照。每个样品三个平行。置二氧化碳培养箱中37℃培养72 h。培养结束前4 h，每孔加入10 uL MTT（5 mg/mL），继续培养4 h。培养结束后，离心10 min（1 000 r/min），弃上清，每孔加入100 uL DMSO使紫色结晶完全溶解。，用酶标仪570 nm波长测定OD值。用加ConA孔的OD值减去不加ConA孔的OD值代表淋巴细胞的增殖能力。

（3）NK细胞活性。

实验前24 h将靶细胞进行传代培养，调整细胞浓度为4×105个/mL。脾细胞取材、红细胞裂解、洗涤、细胞计数同1.2.3.1。调整脾细胞浓度为2×107个/mL。取靶细胞和效应细胞各100μL（效靶比50∶1），加入96孔培养板中。靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100 μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5%Triton各100 μL。每个样品三个平行。置二氧化碳培养箱中37℃培养4 h。然后离心5 min（1 500 r/min），每孔吸取上清100μL置新的96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，反应3 min，每孔加入30μL1mol/L的HCl，用酶标仪490 nm波长测定OD值。

（4）碳廓清实验[16]。

称体重，从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁，按每10 g体重0.1 mL计算。待墨汁注入，立即计时。注入墨汁后2 min和10 min，分别从内眦静脉丛取血20μL，并立即将其加到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中。用分光光度计600 nm波长测定OD值，以Na2CO3溶液作空白对照。将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重。计算碳廓清指数a。

（5）腹腔巨噬细胞吞噬作用[17]。

处死小鼠，腹腔注射4 mL1640培养基(加10%灭活胎牛血清)。吸出3 mL洗液，1 500 r/min离心5 min，去上清，重悬至1 640培养基，至细胞数为1×106cells/mL。每孔200 uL加入96孔板，置二氧化碳培养箱37℃培养3 h后，用PBS洗3次，吸出未黏附的细胞[18]。将黏附的细胞重悬在200 uL 1640培养基(加10%灭活胎牛血清)，置二氧化碳培养箱37℃培养24 h，去除培养基，每孔加入100 uL 0.072%中性红，培养0.5 h。去除混合液，用PBS洗3次以除去多余的染液。吸干。细胞重悬于含1%冰醋酸的50%乙醇中，4℃过夜。用酶标仪540 nm波长测定OD值。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离

从革兰氏染色阳性、无运动性、镜检、16SrDNA分子鉴定结果显示，共分离得到乳酸菌232株，其中杆菌142株，球菌90株，这些菌株均在《可食用菌种名单》中。

2.2 提高免疫力乳酸菌的体外细胞筛选

2.2.1 体外脾淋巴细胞增殖

对分离到的232株乳酸菌进行体外脾淋巴细胞转化实验，在诱导剂ConA存在和不存在的情况下，均能显著促进脾淋巴细胞增殖的益生菌作为优选菌株。表1为效果前15位的菌株信息，有从酥油、泡菜、酸奶等样品中分离得到的（副）干酪乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌等多种菌种。

表1 促进体外脾淋巴细胞增殖的部分菌株

表1 促进体外脾淋巴细胞增殖的部分菌株

菌株编号1746 575 691 1889 2544 563 1668 1789 2480 1672 685 2679 675 1738 2556不加诱导剂倍数值2.652±0.551 2.445±0.140 2.406±0.378 2.390±0.323 2.364±0.217 2.355±0.154 2.264±0.056 1.659±0.167 1.912±0.087 1.715±0.084 1.968±0.209 1.505±0.116 1.649±0.211 1.653±0.124 1.928±0.189 ConA(10μg/mL)倍数值1.510±0.147 1.498±0.238 1.685±0.333 1.494±0.190 1.281±0.148 1.357±0.077 2.052±0.171 2.390±0.268 1.533±0.109 1.770±0.3132 1.502±0.187 1.795±0.250 1.839±0.196 1.536±0.128 1.308±0.104菌株信息采集地西藏四川青海西宁西藏青海西宁四川西藏热撒乡多岗村西藏边雄乡新疆那拉提红山沟西藏洛布村西宁阿拉山口市，博乐西宁西藏新疆托里县城店样品形式羊酥油泡菜3号酸奶酸奶酸奶泡菜14号青稞酒酸奶酸奶牦牛酥油酸奶酸奶酸奶酵头（固态）牦牛酥油奶油鉴定信息（副）干酪乳杆菌植物乳杆菌发酵乳杆菌瑞士乳杆菌动物双歧杆菌植物乳杆菌发酵乳杆菌罗伊氏乳杆菌瑞士乳杆菌瑞士乳杆菌植物乳杆菌干酪乳杆菌植物乳杆菌（副）干酪乳杆菌瑞士乳杆菌

2.2.2 体外脾淋巴细胞细胞因子测定

对具有促脾淋巴细胞增殖效果的77株菌（包括表1中的15株菌）进行脾淋巴细胞细胞因子IL-10和IL-12的测定。结合促进体外脾淋巴细胞增殖效果较好的菌株和IL-12/IL-10比值较高的菌株，筛选出具有免疫调节潜力的益生菌8株，见表2。

2.3 乳酸菌的动物实验筛选

结合体外细胞实验的结果，选取675、691、1738和1011四株菌进行动物实验的筛选。

表2 体外脾淋巴细胞细胞因子IL-12和IL-10的测定

2.3.1 脏器指数

脾脏是T、B淋巴细胞定居和对抗原物质产生免疫应答及免疫效应物质的重要器官。胸腺是T淋巴细胞发育成熟的场所。脾脏指数和胸腺指数可间接反映机体的免疫水平。与空白组相比，模型组小鼠脏器比显著降低，表明免疫低下小鼠造模成功。与模型组相比，菌株675、1011和691显著提高脏器比（P＜0.05），脾脏指数（mg/g）从2.823分别提高到3.363、3.527和3.499，胸腺指数（mg/g）从0.885分别提高到1.225、1.178和1.232（见图1）。可见这3株菌675、1011和691可促进免疫低下小鼠脏器的恢复。

图1 各实验组小鼠脾脏指数和胸腺指数的测定

2.3.2 脾淋巴细胞增殖反应

淋巴细胞增殖能力的强弱直接影响到机体免疫水平。Jang SE等人在免疫低下小鼠模型中，模型组ConA诱导的淋巴细胞增殖值仅为空白对照组的54%，而干酪乳杆菌HY7213处理组是空白对照组的95%，显著提高淋巴细胞的增殖能力[11]。本研究中菌株1011和691显著促进脾淋巴细胞的增殖，OD570值从 0.197分 别 提 高 到 0.264（P＜0.05）和 0.322（P＜0.001）。相比于模型组小鼠的OD 570值是空白对照组的58%，菌株691组小鼠的OD570值达到空白对照组的85%。如图所示2。

图2 各实验组小鼠脾淋巴细胞增殖OD570的测定

2.3.3 NK细胞活性

NK细胞在免疫方面有重要的作用，是机体非特异性免疫的重要组成部分。本研究中，与模型组相比，菌株（副）干酪乳杆菌1011显著提高NK细胞的活性，从51.9%提高到73.3%（P＜0.05）。而同样是（副）干酪乳杆菌的1738，其NK细胞活性与模型组没有显著差异，表明菌株之间的差异性。菌株691极显著提高NK细胞的活性，从51.9%分别提高到77.6%（P＜0.01），如图3所示。

图3 各实验组小鼠NK细胞活性的测定

2.3.4 碳廓清实验

小鼠碳廓清法，是利用测定血中异物的清除速度来反映单核吞噬细胞的吞噬功能的原理，间接的反映机体的免疫功能[19]。与模型组相比，菌株1738、1011和691显著提高小鼠的吞噬指数，分别从3.371提高到4.127（P＜0.05）、4.256和4.250（P＜0.01），如图4所示。表明这3株菌具有提高巨噬细胞清除异物的能力，提高机体的非特异性免疫力。

图4 各实验组小鼠碳廓清指数的测定

2.3.5 腹腔巨噬细胞吞噬作用

巨噬细胞是重要的免疫调节和效应细胞，通过吞噬和分泌多种细胞因子的途径来控制机体的炎症反应和免疫应答。吞噬中性红的强弱可间接反映巨噬细胞的吞噬能力。Yueyue Meng等人[17]考察小鼠巨噬细胞吞噬中性红的能力，与模型组相比，OD540值从0.087提高到约0.14（P＜0.05）。本研究中，与模型组相比，菌株691 OD540值从0.136提高到0.162（P＜0.05），如图5所示。表明菌株691具有提高小鼠的吞噬作用的能力。

图5 中性红法检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的结果

3 结 论

我国有极其丰富的传统食品，不同来源的发酵制品中蕴藏着种类丰富的乳酸菌。本文从新疆等地采集的各种形式的传统食品中分离得到232株乳酸菌。对这232株乳酸菌进行了体外细胞筛选，包括促进体外脾细胞增殖和脾淋巴细胞分泌细胞因子IL-10和IL-12的实验。通过体外细胞实验，筛选出4株可能具备免疫调节功能的菌株（675，1738，1011和691）。并对这4株菌进行动物实验，采用腹腔注射环磷酰胺建造免疫低下小鼠模型，最终确定发酵乳杆菌691具有提高免疫力的功能。

环磷酰胺主要是通过DNA烷基化破坏DNA的合成而非特异性杀伤淋巴细胞，并可抑制淋巴细胞转化，造成小鼠的免疫力低下[20]。免疫器官胸腺及脾脏的脏器比值是衡量机体免疫状况的初步指标[21]。发酵乳杆菌691显著增加胸腺指数和脾脏指数（P＜0.01），有效的促进了免疫受损小鼠的脏器恢复。淋巴细胞由淋巴器官产生，是机体免疫应答功能的重要细胞成分，具有免疫识别功能，可分为T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞。自然杀伤(NK)细胞是机体非特异性免疫系统的重要组成部分，在机体抗病毒、抗肿瘤及免疫调节中都起着重要作用[22]。益生菌促进淋巴细胞增殖和NK细胞的活性，说明在机体的体液免疫和细胞免疫两方面都有作用。发酵乳杆菌691可以显著刺激脾淋巴细胞增殖，实验中的OD570值从0.197提高到0.322（P＜0.001），NK细胞活性从51.9%提高到77.6%（P＜0.01）。巨噬细胞作为最重要的抗原呈递细胞，是诱发免疫应答的先决条件，其作为非特异性免疫细胞可吞噬或杀伤癌细胞及外来异己细胞。单核巨噬细胞吞噬能力能够有效衡量机体非特异性免疫功能，而巨噬细胞的碳廓清指数与吞噬指数可有效反映内皮网状系统吞噬功能的强弱，提高其吞噬活性可有效防卫微生物侵袭[23-25]。发酵乳杆菌691碳廓清指数从3.371提高到4.250（P＜0.01）和吞噬实验OD540值从0.136提高到0.162（P＜0.05）。

本研究通过造模免疫力低下小鼠，饲喂乳酸菌，检测脏器比、细胞免疫功能、单核-巨噬细胞功能及NK细胞活性等方面，结果显示，一株从青海西宁酸奶样品中分离得到的发酵乳杆菌691具有提高免疫力的功能，促进环磷酰胺引起的小鼠免疫功能抑制的恢复。