乳铁蛋白铁饱和度对其耐热性、抑菌作用及抗氧化性的影响

王淑晨，于景华，刘晓辉，骆志刚

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457；2.北京银河路经贸有限公司，北京100600）

0 引 言

乳铁蛋白（Lf）是一种天然的结合性球状糖蛋白，属于转铁蛋白家族，具有非常高的等电点[1]，牛乳铁蛋白的等电点在pH值为8.0左右，人乳铁蛋白的等电点在p H值为6.0左右。乳铁蛋白最初是在60多年前作为牛奶中的“红色蛋白”被发现的，自1960年首次从母乳和牛奶中提纯以来它就已经成为强化结构和功能研究的主题[2]。乳制品加工过程中采用的热杀菌工艺，非常容易导致乳铁蛋白的变性，所以乳铁蛋白的热稳定性以及影响其热稳定性的因素成为了乳制品加工行业关注和研究的热点。乳铁蛋白最引人注目的特征就是它具有对铁非常高的亲和力。乳铁蛋白能够结合两个铁离子，它对铁的亲和力常数比转铁蛋白高300倍，并且由于其基本性质，它可以在较低的pH值下保留铁[3]。因为不同铁饱和度乳铁蛋白结合铁的能力不同，所以乳铁蛋白铁饱和度会对其耐热性、抑菌作用及抗氧化性产生一定的影响。

1 乳铁蛋白概况

1.1 乳铁蛋白的含量

乳铁蛋白在人乳、牛乳中广泛存在，在动物体的泪液、唾液、汗液、胰液、胆汁、精液等内外分泌液中也存在，但在分泌物中含量甚微，没有在乳汁中的含量高。它是母乳中第二多的蛋白质，含量约占普通母乳蛋白质的10%，在初乳中含量为7 g/L，随着乳汁的成熟乳铁蛋白的含量会有所下降，在普通乳中占1 g/L左右。牛乳中含有乳铁蛋白的含量比人乳中要少得多，在中期泌乳期仅为0.1 g/L。另外，在猪、骆驼、马、水牛、山羊和老鼠等的乳中也能分离到乳铁蛋白，但商业上使用的乳铁蛋白一般是从牛乳中提取的。

1.2 乳铁蛋白的结构

牛乳铁蛋白是由具有689个氨基酸和4个聚糖的单一多肽链组成，分子量为80～84 ku，其多肽链上附有两条碳水化合物侧链。碳水化合物的含量为7%左右，组成包括半乳糖、甘露糖、N-乙酰半乳糖胺、岩藻糖以及涎酸等。乳铁蛋白折叠成两个同源的球状叶，N-叶和C-叶分别代表分子的N-和C-末端。每个叶片由两个子叶片组成[4]。这些子叶片能够在碳酸盐存在下可逆地结合铁离子（Fe3+）。乳铁蛋白能够以高亲和力（KD～10-20M）结合铁[5]，但也能够以较低的亲和力结合许多其他金属离子。

人乳铁蛋白与牛乳铁蛋白结构相似，氨基酸残基组成单链，两端折叠成球形（N叶和C叶），中间由一段螺旋肽链连接呈现“二枚银杏叶型”结构。乳铁蛋白两叶结构基本相似，不同之处在于表面环状叶结构，每叶都有2个相似的α/β区域，其中一叶基于6束β-层状结构，另一叶基于5束β-层状结构。N端和C端的球状结构包括3个区域，每端可各与一个铁离子结合，此位点位于一个裂口内，它与铁结合的同时结合一个CO32-（或2个HCO3-离子），以保持电荷平衡。

1.3 氨基酸序列

牛乳铁蛋白氨基酸序列是由cDNA序列推定的，人乳铁蛋白序列是由氨基酸序列测定和cDNA序列推断得出的。其它哺乳动物如山羊、猪、小鼠等乳铁蛋白序列也有报道，目前乳铁蛋白的序列数据库包含来自9种物种的Lf序列：人，小鼠，牛，马，猪，山羊，绵羊，水牛和骆驼。这些蛋白质共享成对同一性，其范围从最小约65%到接近100%。主要异常值是人类和小鼠的乳铁蛋白，它们分别与其他的乳铁蛋白一起显示70%～74%和65%～70%的同一性[6]。

1.4 生理功能

乳铁蛋白具有多种生理功能，如促进铁吸收、促进细胞增殖、调节骨髓细胞生成[7]、调节补体系统、刺激溶菌酶再生、防止脂肪氧化等。乳铁蛋白还可以与许多物质以非共价键可逆的方式结合，包括金属离子、蛋白、细胞以及DNA。具有广谱抗菌、抗病毒等免疫作用[8]，可作为天然的抗氧化剂，能消炎、抗感染，促进肠道菌群的平衡，并能促进细胞生长和DNA合成，还可抑制癌变[9]。最近还有研究表明乳铁蛋白在代谢紊乱方面也有一定的作用，如预防肥胖、糖尿病和心血管疾病等[10]。乳铁蛋白的抗菌作用和抗氧化作用都与乳铁蛋白能螯合铁的能力有关，所以在生理功能方面，本文研究了乳铁蛋白的铁饱和度对抗菌作用和抗氧化作用的影响。

2 铁饱和度

乳铁蛋白的铁饱和度是指乳铁蛋白中的铁与乳铁蛋白总铁结合能力的百分比。乳铁蛋白的二级结构呈“二枚银杏叶型”结构，铁离子的结合点位于两叶的切入部分，乳铁蛋白的N端和C端可各与一个铁离子结合，一分子的乳铁蛋白可以结合两个铁离子。理论上1 mol乳铁蛋白结合2 mol铁，1 g乳铁蛋白含有1.4 mg铁被认为是100%饱和的。乳铁蛋白粉可以按照乳铁蛋白铁饱和度进行分类，铁饱和度低于5%的乳铁蛋白被称为缺铁乳铁蛋白（apo-Lf），铁饱和度高于85%的乳铁蛋白被称为铁饱和乳铁蛋白（holo-Lf），天然的牛乳铁蛋白的铁饱和度为15%左右，人乳铁蛋白的铁饱和度为4%左右。

测定乳铁蛋白铁饱和度最简单的方法是基于分光光度测量[11]。总蛋白质浓度可以使用280 nm处的吸收系数来确定，而铁饱和形式的浓度可以通过使用466 nm处的摩尔吸光系数来估计。但是应用吸收系数来计算蛋白质浓度仅限于当溶液中仅存在apo或holo形式时的情况。当制剂是两种形式的混合物时，使用该方法可导致显着的偏差。为了能更准确的测定乳铁蛋白中的铁饱和度，将电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）与Dumas的方法结合来测定，即使用电感耦合等离子体质谱测定乳铁蛋白中铁的含量，使用Dumas的方法来测定出乳铁蛋白的蛋白质含量[12]。乳铁蛋白的铁含量还可以用光学发射光谱或原子吸收光谱技术精确测定，蛋白质的含量还可以应用ELISA的方法[13]，使用牛乳铁蛋白ELISA定量试剂盒来测定乳铁蛋白的蛋白质含量。

3 铁饱和度对乳铁蛋白耐热性的影响

乳铁蛋白容易受热失活，牛乳铁蛋白在pH值为6.6、温度为65～69℃时开始失活，人乳铁蛋白在70℃加热处理15～30 min就已经完全失活。目前，差示扫描量热法（DSC）已被广泛地用于检测和监测温度对样品的热诱导构象和相变。通过差示扫描量热法研究纯化的牛乳铁蛋白apo-Lf、天然-Lf和holo-Lf3种形式的热稳定性，它们的变性温度分别为60～66℃、70～73℃、88～92℃。当乳铁蛋白用铁饱和时，其最大温度，起始温度和变性的焓变化高于其天然形式和apo形式[14]。

乳铁蛋白中铁结合的多少会影响乳铁蛋白的分子构象。与无铁乳铁蛋白相比，具有结合铁的乳铁蛋白具有更紧凑的结构，因为在乳铁蛋白的每个叶中的开放域间裂隙在铁离子结合的情况下被封闭。关于叶片结构，C-叶的两个结构域在铁部位上比N-叶的结构更封闭，铁释放的更快，这导致更高的热力学稳定性，C部位铁的有效性高于N部位[15]。随着铁饱和度的增加，蛋白质稳定性增加。随后，在研究山羊乳铁蛋白和牛乳铁蛋白的热稳定性时也验证了这一规律。通过差式扫描量热法来测定山羊乳铁蛋白和牛乳铁蛋白的热变性温度[16]，它们的铁饱和度分别为5%和15%。山羊乳铁蛋白的热变性温度为66℃，牛乳铁蛋白的热变性温度为70℃，牛乳铁蛋白的铁饱和度高于山羊乳铁蛋白的铁饱和度，牛乳铁蛋白的热变性温度高于山羊乳铁蛋白的，加热后，牛乳铁蛋白比山羊乳铁蛋白更稳定。

通过空间排阻色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳相结合的方法，来研究铁饱和度对乳铁蛋白加热后热聚集的影响。Apo-Lf和天然-Lf的热敏感性比holo-Lf要高，加热至80℃会形成大的不溶性聚集体，而holo-Lf加热至80℃时才刚形成可溶性聚集体。Apo-Lf和天然-Lf的热展开率要高于holo-Lf。乳铁蛋白的聚集是通过非共价相互作用和游离巯基残基的分子间硫醇/二硫化物反应的组合进行的。乳铁蛋白的两个裂片会在铁饱和的状态下闭合，可以将两个蛋白质裂片核心的非共价位点隐藏起来，减少分子间的相互作用和不溶性聚集体的形成。铁饱和度也在较高温度下稳定了二硫化物键的完整性[17]。铁饱和度增加了holo-Lf的稳定性，从而减少了聚集，增加了蛋白质聚合物的溶解度。holo-Lf的更紧凑的构造使其在加热时不会聚集。乳铁蛋白的聚集取决于铁饱和度。铁饱和度越高，加热时形成的不溶性聚合物就会越少，乳铁蛋白的热稳定性就越好。

4 铁饱和度对乳铁蛋白抗菌作用的影响

Bullen等[18]在1972年首次提出乳铁蛋白具有抑菌作用。乳铁蛋白可夺取需铁细菌所必需的铁元素，从而抑制其生长。乳铁蛋白还能与微生物菌体发生凝集作用，使之死亡。Arnold等[19]通过萤光免疫研究发现，apo-Lf可与菌体表面结合，从而隔断外界营养物质进入菌体，致使菌体死亡。现在已经确定，乳铁蛋白属于广谱抑菌剂，既可抑制需铁的革兰氏阴性菌，如大肠菌群，E.Coli、沙门氏菌、志贺菌等;也可抑制革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌、单细胞李斯特菌等。但对铁需求不多的微生物，如乳酸菌，则基本不抑制。乳铁蛋白对变异链球菌、霍乱弧菌等有直接致死作用，且与铁无关。

乳铁蛋白抑菌效果取决于微生物对铁的需求程度、外源铁的生物利用率、乳铁蛋白的铁饱和度、盐类、p H值、抗体或其它免疫物质、介质等。目前认为乳铁蛋白抗菌机理可能有以下三个方面：首先，乳铁蛋白对革兰氏阴性菌和阳性菌的抑菌作用是由于乳铁蛋白高度结合铁，使细菌失去生长所需基本元素铁，乳铁蛋白铁饱和度越低，抑菌效果会越好；其次，乳铁蛋白通过氨基末端强阳离子结合区域，增加细菌细胞膜通透性，使细菌脂多糖从外膜渗出，达到直接杀菌作用；另外，乳铁蛋白可通过水解得到抗菌肽实现抗菌作用。将乳铁蛋白通过蛋白酶水解获得一些低分子量，这些肽抗菌活性大幅增强，可抑制革兰氏阴性菌和阳性菌的生长[20]。

表1 乳铁蛋白能抑制的细菌

乳铁蛋白可以结合细菌所需的铁来达到抑菌效果，不同铁饱和度乳铁蛋白的结合铁的能力不同，铁饱和度低的乳铁蛋白结合铁的能力要强于铁饱和度高的乳铁蛋白。那么随着铁饱和度的升高，乳铁蛋白的抑菌性降低。

5 影响 铁饱和度对乳铁蛋白抗氧化作用的

机体内氧自由基过剩时，会引起脂质的过氧化，损伤细胞和组织的生物膜结构，是衰老或疾病的征兆。Fe3+可以催化产生引起心血管疾病、肠道癌的自由基，游离的Fe3+参与氧自由基反应，聚集在炎症或受感染部位的Fe3+和Fe2+会催化自由基反应[32]，导致机体出现过多的氧自由基。因此，过量的铁在机体内也会引发负面影响。乳铁蛋白能抑制铁诱导的脂质过氧化过程中硫代巴比妥酸和丙二醛的生成。另外，牛乳铁蛋白还具有核糖核酸酶的活性，能降解酵母中的tRNA，并且还能抑制超氧离子的形成。因此，乳铁蛋白能够降低人体内自由基对动脉血管壁弹性蛋白的破坏，以达到预防和治疗动脉粥样硬化和冠心病的目的。

Gutteridge等[33]发现20%铁饱和度下的乳铁蛋白和转铁蛋白在pH7.4的溶液中能抑制铁催化的牛脑磷脂脂质体的脂质过氧化，但在这两种蛋白质饱和之后就消除了它们的抑制作用。通过测量氢氧化物（共轭二烯）的形成和氢过氧化物（己醛）的分解来评估乳铁蛋白作为金属螯合剂的有效性，发现天然牛乳铁蛋白可以在pH 6.6和50℃下抑制了缓冲玉米油乳液和卵磷脂脂质体系中的过氧化氢和六氟烷的生成，起到了抗氧化的作用[34]。抗氧化活性随着乳铁蛋白浓度的增加而增加。乳铁蛋白的抗氧化效果还可以通过分光光度法测定乳铁蛋白的脂质过氧化抑制率、羟自由基(·OH)清除率和DPPH自由基清除率来确定。在水包油乳液中，天然乳铁蛋白和铁饱和乳铁蛋白在最初的时候都能起到抗氧化剂的作用，都减少了过氧化物的产生，但是在48 h之后，含有铁饱和乳铁蛋白的乳液中产生的过氧化物更多[35]。铁饱和乳铁蛋白的抗氧化活性要低于非饱和的乳铁蛋白。乳铁蛋白降低吞噬细胞的羟自由基产生，从而抑制了单核细胞膜的铁催化自动氧化反应。于是，可认为乳铁蛋白的抗氧化机制主要是螯合了易引起氧化的铁离子。乳铁蛋白的抗氧化剂活性取决于脂质体系，缓冲液，其浓度，金属离子的存在和氧化时间。乳铁蛋白的抗氧化能力会随着其浓度的增加而升高；通常只要有痕量的铁或铜等催化剂存在，就会导致氧自由基的产生，因此可以用乳铁蛋白作为螯合剂来减少自由基的生成量，以此来达到抗氧化的作用，体系中金属离子的存在会降低乳铁蛋白的抗氧化能力；随着氧化时间的增加，乳铁蛋白的抗氧化能力会逐渐减弱。

乳铁蛋白可以结合游离的铁离子来达到抗氧化的作用，无铁乳铁蛋白结合铁的能力要强于铁饱和乳铁蛋白，无铁乳铁蛋白的抗氧化能力是最好的，随着铁饱和度的增加，乳铁蛋白的抗氧化性逐渐减弱。

6 结语

乳铁蛋白的铁饱和度对它的耐热性、抗菌作用、抗氧化性产生了一定的影响。乳铁蛋白的分子构象随着铁与其铁结合位点结合的变化而变化。与无铁乳铁蛋白相比，具有结合铁的乳铁蛋白具有更紧凑的结构，因为在乳铁蛋白的每个叶中的开放域间裂隙在铁离子结合的情况下被封闭，所以随着乳铁蛋白铁饱和度的增加，乳铁蛋白受热更稳定。乳铁蛋白可以高度结合铁离子，使细菌失去所必需的铁元素而失活，螯合了易引起氧化的铁离子，所以无铁乳铁蛋白的抑菌性要强于铁饱和的乳铁蛋白，铁饱和乳铁蛋白的抗氧化活性要低于非饱和的乳铁蛋白。