不同灭菌方式对螺旋藻及其发酵后营养功效成分的影响

刘云鹏　尤升波　马德源　尤常清　乌日娜　武俊瑞　黄超　于金慧　毕玉平

摘要：為明确不同灭菌方式对螺旋藻功效成分的影响，本研究采用高温蒸汽灭菌、超高压灭菌和紫外线灭菌三种方式对螺旋藻培养基进行灭菌处理，并结合乳酸菌发酵方法，比较分析不同灭菌方式处理下发酵前后上清液与固形物中总黄酮、总酚、藻蓝素等成分含量，并对其抗氧化活性进行测定。结果表明，发酵前，不同灭菌方式下各成分含量差异较大，部分达显著水平，其中，以高温蒸汽灭菌的上清液总黄酮和总酚含量最高，藻蓝素含量最低;固形物醇提液中总黄酮含量则以超高压灭菌最高，总酚和藻蓝素含量以紫外线灭菌的最高。经乳酸菌发酵后，总黄酮和藻蓝素含量整体呈下降趋势，最大降幅分别为60.0%、74.9%，总酚的变化与之相反，增幅最高为142.4%。从抗氧化活性来看，三种灭菌方式之间抗氧化活性具有一定差异;乳酸菌发酵提高了高温灭菌的上清液中总抗氧化能力、DPPH自由基清除能力，高压灭菌的还原力和亚铁离子螯合能力;而发酵后固形物醇提液的总抗氧化能力、还原力和亚铁离子螯合能力均显著升高，DPPH自由基清除能力略有下降。综合各因素，高温蒸汽灭菌可用于开发螺旋藻益生菌产品。

关键词：螺旋藻;高温蒸汽灭菌;超高压灭菌;紫外线灭菌;功效成分;抗氧化活性

中图分类号：S555+.609.9文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）10-0065-06

Effects of Different Sterilization Methods on

Functional Components of Spirulina and after Fermentation

Liu Yunpeng1，2， You Shengbo1， Ma Deyuan1， You Changqing3，

Wu Rina4， Wu Junrui4， Huang Chao1， Yu Jinhui1， Bi Yuping1

（1. Biotechnology Research Center， Shangdong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China;

2. College of Life Sciences， Shandong Normal University， Jinan 250014， China;

3. College of Life Sciences， Shihezi University， Shihezi 832003， China;

4. College of Food Science， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China）

Abstract In order to determine the effect of different sterilization methods on the effective components of Spirulina， the high-temperature steam sterilization， ultrahigh-pressure sterilization and ultraciolet sterilization were adopted and compared. The contents of total flavonoids， total phenols， and phycocyanin in the supernatant and solid matter of Spirulina before and after fermentation were analyzed under sterilization， as well as the antioxidant activity. The results showed that there were significant differences in the content and antioxidant activity of each component under different sterilization methods before fermentation. Among them， the content of total flavonoids and total phenols in supernatant was the highest when sterilized by high-temperature steam， while the content of phycocyanin was the lowest; the content of total flavonoids in alcohol extract of solid matter was the highest under ultrahigh-pressure sterilization， while the content of phycocyanin and total phenols were the highest under ultraviolet sterilization. After fermentation with lactic acid bacteria， the content of total flavonoids and phycocyanin showed an overall downward trend with the largest decrease of 60.0% and 74.9% respectively. In contrast， the total phenols increased with the highest increase of 142.4%. From the perspective of antioxidant activity， there were some differences in the three sterilization methods. After fermentation， in the supernatant， the total antioxidant capacity and DPPH scavening ability under high-temperature sterilization and the reducing power and chelating ability of ferrous ion under high-pressure sterilization were enhanced; and the total antioxidant capacity， reducing ability and chelating ability of ferrous ion in the alcohol extract of solid matter increased significantly， while the DPPH scavening ability decreased slightly. Considering all the factors， high-temperature steam sterilization could be used to develop probiotics products of Spirulina.

Keywords Spirulina; High-temperature steam sterilization; Ultrahigh-pressure sterilization; Ultraciolet sterilization; Functional component; Antioxidant activity

螺旋藻是一种圆柱形螺旋状的丝状体微藻，不仅蛋白含量（60%）高，而且富含多糖、多不饱和脂肪酸、植物色素、维生素及微量元素等。王娜等[1]研究表明，螺旋藻蛋白质数量高达2 085个，并发现蛋白超家族在抗氧化、抗癌、抗肿瘤、免疫调节等方面具有重要功能。因此，螺旋藻是适合人们食用、保健、医用的优良微藻资源。市场上螺旋藻的加工产品形式多为螺旋藻粉、螺旋藻片，近几年也有螺旋藻在饮料[2]、面条[3]、馒头[4]、面包[5]以及复合片剂[6，7]等方面的应用研究。

目前，很多学者尝试将螺旋藻与益生菌结合，开展螺旋藻发酵的相关研究[6，7]。益生菌发酵是开展螺旋藻深加工的良好途径，可进一步提升螺旋藻的价值。发酵过程中，通常在接入菌种之前需要对物料进行灭菌，而灭菌对物料本身的品质具有一定影响。在以往螺旋藻发酵相关的报道中，Bao等[8]在开展研究时使用紫外线灭菌藻粉的方法，韩庆等[9]在制作螺旋藻乳酸菌饮料时使用巴氏方法对螺旋藻进行灭菌处理，然而并没有对灭菌方式进行特殊说明和比较研究。

为了保证灭菌后螺旋藻营养功效成分和活性，本研究对高温蒸汽灭菌、超高压灭菌和紫外线灭菌三种方法进行综合比较，分析不同方法灭菌后乳酸菌发酵前后上清液和固形物中的成分差异，同时对发酵前后的上清液和固体物的抗氧化活性进行测定，旨在为螺旋藻益生菌发酵相关产品的开发和应用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

螺旋藻购自鄂托克旗森泰螺旋藻有限公司;植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum DY-1）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei KDB-LC）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus KDB-03）为本实验室分离保存菌种;凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans GIM1.645）购自广东省微生物菌种保存中心。

1.2 主要试剂与仪器设备

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏购自北京奥博星生物技术有限公司，柠檬酸氢二铵[（NH4）2HC6H5O7]、葡萄糖（C6H12O6·H2O）、乙酸钠（CH3COONa·3H2O）、磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）、硫酸镁（MgSO4·7H2O）、硫酸锰（MnSO4·H2O）、氯化亚铁等购自国药集团化学试剂有限公司;琼脂粉购自北京索莱宝科技有限公司;抗坏血酸购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;菲啰嗪、芦丁和没食子酸购自Sigma-Aldrich;福林试剂（Folin-Ciocalteu）购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

电子天平（JA5003），上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品;超净台（YT-CJ-2D/B），北京亚泰科隆仪器技术有限公司产品;微生物培养箱（HZQ-X100），哈尔滨市东明医疗仪器厂产品;立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-75KB），上海申安医疗器械厂产品;超高压设备（UHPF-750MPa），内蒙古包头科发新型高技术食品机械有限责任公司产品;超声清洗仪（SB25-12 DTD），宁波新芝生物技术有限公司产品;电热恒温水浴锅（DK-S24），上海森信实验仪器有限公司产品;超纯水仪[FYY（40-120）01/02]，青岛富勒姆科技有限公司产品;干燥箱（DHG-9030A），浙江赛德仪器设备有限公司产品;紫外可见分光光度计（756PC），上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 培养基配制 螺旋藻培养基：葡萄糖20 g，螺旋藻干粉10 g，蒸馏水定容至 1 000 mL。

MRS培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，柠檬酸氢二铵2 g，葡萄糖20 g，乙酸钠5 g，磷酸氫二钾2 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH值为 6.2～6.6;固体培养基添加1.8%琼脂，115℃灭菌20 min。

1.3.2 灭菌方法 高温蒸汽灭菌：将上述培养基置蓝口瓶中115℃灭菌20 min;超高压灭菌，将上述培养基用聚乙烯塑料袋（13 cm×17 cm）密封，30℃、450 MPa处理10 min，通过无菌操作转移至已灭菌蓝口瓶中;紫外线灭菌：将螺旋藻干粉薄薄一层铺在硫酸纸上，放置于超净工作台中距离紫外灯管30 cm处，过夜灭菌，通过无菌操作将其转移至已经灭菌的蒸馏水中（含2%葡萄糖）。将上述三种方法灭菌的螺旋藻培养基置室温放置3 d后，无污染即可进行后续试验。

1.3.3 样品制备 将1.3.2中经三种方法灭菌后样品分为两份。一份于5 000 r/min离心5 min分离上清液和固形物，其中固形物于45℃烘干，过80目筛，取1 g加入50 mL 70%乙醇溶液进行三次超声萃取，超声频率20 kHz，超声功率40 W，每次超声时间10 min，分离上清液得到灭菌后固形物醇提液（20 mg/mL）。另一份经乳酸菌发酵后进行上清液和固形物分离，操作同上，分别得到发酵后上清液和发酵后固形物醇提液（20 mg/mL）。

1.3.4 乳酸菌发酵 取固体MRS培养基上的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum DY-1）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei KDB-LC）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus KDB-03）和凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans GIM1.645）分别接入MRS液体培养基，置32℃培养箱中活化培养24 h，3 000 r/min离心5 min，弃上清用蒸馏水重悬，依次接入至1.3.2已灭菌的螺旋藻培养基，接种密度均为106 CFU/mL。32℃培养72 h，收集样品进行处理。

1.4 测定指标及方法

参照文献[10]的方法测定总酚、总黄酮含量，对总抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、还原力和亚铁离子螯合能力进行评价，部分指标阳性参照物更改为抗坏血酸（VC）。藻蓝素：根据地方标准DB 53/T 186-2014检测不同处理上清液和固形物中藻蓝素的含量[11]。

1.5 数据处理

利用Microsoft Excel 2010 进行数据统计及作图，SPSS 16.0软件对所得数据进行单因素方差（one-way ANOVA）统计分析，采用Duncans多重比较进行差异显著性分析（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 三种灭菌方式及乳酸菌发酵对活性成分的影响

2.1.1 总黄酮 由图1可以看出，发酵前，以高温蒸汽灭菌的上清液中总黄酮含量最高，超高压灭菌的含量最低;而固形物醇提液中则以超高压灭菌的含量最高，高温蒸汽灭菌和紫外线灭菌的含量无显著差异。经乳酸菌发酵后，上清液和固形物醇提液中总黄酮含量下降，尤以高温蒸汽灭菌的上清液中降幅最大，达60.0%。

2.1.2 总酚 由图2可以看出，发酵前上清液中总酚含量以高温蒸汽灭菌的最高，但经乳酸菌发酵后含量显著下降，降幅达35.8%;超高压灭菌和紫外线灭菌的总酚含量较低，但发酵后二者总酚含量均显著增加。发酵前的固形物醇提液中总酚含量在三种灭菌方式下差别不大，发酵后的则以超高压灭菌的增幅最大，达142.4%。

2.1.3 藻蓝素 由图3可以看出，发酵前后的上清液和固形物中藻蓝素含量均以高温蒸汽灭菌的最低，以超高压灭菌的上清液中藻蓝素含量最高，固形物中则以紫外线灭菌的最高。整体来看，乳酸菌发酵显著降低了上清液和固形物中藻蓝素的含量，其中上清液的降幅为38.0%～52.7%，固形物的降幅为64.0%～74.9%。

2.2 三种灭菌方式及乳酸菌发酵对抗氧化活性的影响

2.2.1 总抗氧化能力 由图4可以看出，发酵前，上清液的总抗氧化能力以紫外线灭菌的最高，高温蒸汽灭菌的最低;固形物醇提液的则以高温蒸汽灭菌的最高，不同灭菌方式下差异显著。经乳酸菌发酵后，超高压灭菌和紫外灭菌的上清液总抗氧化能力下降，高温蒸汽灭菌的上清液和固形物醇提液的抗氧化能力均显著增加。其中，高温蒸汽灭菌下，固形物醇提液的抗氧化能力显著高于对照VC;相比发酵前，高温蒸汽灭菌的上清液总抗氧化能力（OD695）提高幅度最大，达44.4%。

2.2.2 DPPH自由基清除能力 由图5可以看出，发酵前，上清液的DPPH自由基清除能力以紫外线灭菌的最强，超高压灭菌的次之，分别为90.5%、86.6%，而经乳酸菌发酵后二者的DPPH自由基清除能力均显著下降。三种灭菌方式的固形物醇提液DPPH自由基清除能力无显著差异，发酵后仅高温蒸汽灭菌的DPPH自由基清除能力显著下降。发酵前后上清液和固形物醇提液的DPPH自由基清除能力均显著低于对照。

2.2.3 总还原力 由图6可以看出，发酵前，上清液的还原力以高温蒸汽灭菌的最高，超高压灭菌的最低;经乳酸菌发酵后高温蒸汽灭菌和紫外线灭菌的还原力显著下降。不同灭菌方式固形物醇提液的还原力以高温蒸汽灭菌的最低，超高压灭菌和紫外线灭菌的还原力无显著差异，而发酵后三者的还原力均显著增加，以超高压灭菌的增幅最大，达104.4%。发酵前后上清液和固形物提取液的还原力均显著低于对照VC。

2.2.4 亚铁离子螯合能力 由图7可以看出，三种灭菌方式下，发酵前后上清液的亚铁离子螯合能力均较弱;发酵前的固形物醇提液的亚铁离子螯合能力与上清液的相当，而发酵后的则显著增加，其中高温蒸汽灭菌和超高压灭菌的螯合能力提高至对照EDTA的59.6%～60.7%。

3 讨论与结论

本研究利用高温蒸汽灭菌、超高压灭菌和紫外线灭菌三种方式，结合乳酸菌发酵，比较分析不同灭菌方式下螺旋藻发酵前后上清液和固形物中营养功效成分总黄酮、总酚、藻蓝素的变化，并对抗氧化活性包括总抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、还原力和亚铁离子螯合能力等进行评价，得出发酵前，以高温蒸汽灭菌的上清液中总黄酮和总酚含量最高，藻蓝素最低;固形物醇提液中总黄酮含量则以超高压灭菌最高，总酚和藻藍素含量以紫外线灭菌的最高。经乳酸菌发酵后，总黄酮和藻蓝素含量下降，总酚含量除高温灭菌的均增加。藻蓝素是一种热敏性物质，在温度高于60℃后明显下降[12]。本研究采用的高温蒸汽灭菌温度高达115℃，采用此处理的藻蓝素含量最低，与其结果一致。而超高压处理上清液中藻蓝素最高，这可能是由于超高压处理能够显著减小螺旋藻粒径，增加比表面积[13]，具有较好的破壁效果，从而促进了藻蓝素的释放。此外，乳酸菌发酵各处理的藻蓝素含量均显著下降，这可能是发酵过程中藻蓝素发生降解所致[14]。

本研究选择总抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、还原力和亚铁离子螯合能力等指标进行抗氧化活性评价。其中，抗氧化成分能够将Mo（Ⅵ）还原为Mo（Ⅴ），并且在酸性条件下形成绿色Mo（Ⅴ）的磷酸盐，在波长695 nm处有强吸收，因此OD695值越大，就意味着抗氧化能力越强[15]。DPPH·在乙醇溶液中是一种稳定的自由基，其孤对电子在517 nm处有强吸收，自由基清除剂可与孤对电子配对，降低其吸光度值，而降低的程度即可反映自由基清除能力[15]。总还原力是以普鲁士蓝[Fe4[Fe（CN）6]3]的生成量为指标进行评价，抗氧化物质可将[K3Fe（CN）6]六氰合铁酸钾还原成K4Fe（CN）6，再利用Fe3+形成Fe4[Fe（CN）6]3，该物质在波长700 nm处有强吸收[16]，OD700值越高说明样品的还原力越强。此外，抗氧化物质可通过金属离子螯合剂的方式来阻止自由基链式反应，二价铁离子与菲啰嗪结合形成紫色复合物，在波长562 nm处有强吸收，形成的紫色复合物越少，表明抗氧化物螯合铁离子的能力越强。基于各指标的原理不同，可综合评价螺旋藻不同灭菌方式和发酵前后的抗氧化活性。从本研究的抗氧化活性结果来看，三种灭菌方式之间抗氧化活性具有一定差异：乳酸菌发酵提高了高温灭菌的上清液中总抗氧化能力、DPPH自由基清除能力，高压灭菌的还原力和亚铁离子螯合能力;发酵后的固形物醇提液总抗氧化能力、还原力和亚铁离子螯合能力均升高，DPPH自由基清除能力略有下降。

灭菌是进行纯种发酵的前提，发酵培养目前常用的灭菌方法有巴氏灭菌、高温蒸汽灭菌、超高压灭菌等。我们曾采用巴氏杀菌处理培养基，过夜放置后污染严重，证实该杀菌方式不适用于螺旋藻。本研究認为超高压灭菌和紫外线灭菌的最大优势是能够较好地保留螺旋藻的标志成分藻蓝素。尽管超高压灭菌处理能够较好地保证物料色、香、味等[17，18]，然而目前阻碍国内发展超高压食品加工技术的主要因素是设备成本高、投资巨大。同时，经过多次预试验发现紫外线杀菌处理通常需要12 h以上，但是被污染的概率仍然很大，考虑到染菌风险以及处理量，该方法并不适合生产上使用。综合功效成分和抗氧化活性来说，高温蒸汽灭菌发酵前后总酚和总黄酮活性成分以及抗氧化能力均可以保持在一定水平，且高温蒸汽灭菌作为常规灭菌方法较为普及，成本相对较低。因此，我们认为在不单纯以藻蓝素为评价指标的情况下，可采用高温蒸汽灭菌的方式进行螺旋藻的灭菌和后续加工，后期仍需对其营养成分和活性做进一步研究。

致谢：感谢浙江省林业科学院钱华研究员在螺旋藻培养基超高压灭菌实验环节给予的帮助。

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收稿日期：2019-06-13

基金项目：山东省现代农业产业技术体系藻类创新团队建设专项（SDAIT-26-09）;山东省农业科学院青年科研基金项目（2015YQN32）;山东省农业科学院重大科技成果培育计划项目（2015CGPY07）;国家国际科技合作专项（2012DFA30450）

作者简介：刘云鹏（1987—），男，山东济南人，硕士研究生，主要从事微藻的益生菌发酵研究。E-mail： 547169658@qq.com

通讯作者：于金慧（1985—），女，山东济宁人，博士，助理研究员，主要从事微生物资源利用及功能性成分和生物活性研究。E-mail：faith_2002@163.com

毕玉平（1961—），男，山东青州人，博士，研究员，主要从事微藻培养及次生代谢产物积累及活性研究。E-mail：yupingbi@vip.sina.com