秋水仙素诱导百合黄精灵多倍体研究

吴青青1， 胡小京， 崔 嵬1， 杨 澜1， 石乐娟1， 许红娟1， 班甜甜1， 夏景烽

(1.贵州省农业科学院园艺研究所/贵州省园艺工程技术研究中心， 贵阳 550009； 2.贵州大学农学院， 贵阳 550025)

百合(Lilium)是百合科百合属多年生球根草本植物，花大，花色艳丽，花姿优美，是切花、盆花和园林布局的优良材料[1-2]。OT百合品种黄精灵(Yelloween)是东方百合与喇叭百合远缘杂交得到的品种，为二倍体植株，其花黄色，株型美观，花朵直立向上开放，生长迅速，抗病性强，有很高的观赏价值。同时，由于多倍体植株具有器官加大、花期延长、茎干加粗、抗逆性增强等特点，如果利用多倍体诱导技术对黄精灵进行加倍，充分利用多倍体植株的生理优势，则很可能得到更加优秀的新品种。

目前，多倍体育种也在国内百合新品种培育方面得到大量应用，自黄济明[9]首先进行百合多倍体诱导后，刘选明[10]、何林[11]等也做了大量工作，培育了许多优秀的百合多倍体品种。秋水仙素可以阻止纺锤体的形成，是一种高效的多倍体诱导剂，国内外都在大量应用。

黄精灵是优良种质资源，是通过远缘杂交得到的品种。其生长势强，杂种优势明显，但是表现为高度不育，难以应用到杂交育种中。主要原因是其染色体同源性差，在减数分裂联会时难以成功，造成配子发育失败。诱导远缘杂交种的多倍体可以有效改善染色体同源性差的问题，因为这等同于为每条染色体都增加了一条同源染色体，是使用这些种质杂交育种的有效手段[3-8,13]。

流式细胞术(Flow cytometer, FCM)是20世纪80年代兴起的新技术，可以快速、大量地进行细胞层面的检测，通过对细胞内核酸含量的测量，可以准确的判断植物的倍性。不同于传统的根尖生长点染色体观察，流式细胞仪对大量的细胞核进行统计性观测，获得的数据具有广泛性特征，避免了取样造成的误差，结果准确可靠[12]。

本试验尝试使用秋水仙素诱导来获得黄精灵的加倍植株，通过流式细胞仪来筛选出多倍体，并作为进一步杂交育种的材料。

另外，试验中所使用的培养基配方为多年来繁育自育东方百合品种贵阳红所使用配方，将其应用于OT百合黄精灵的多倍体诱导组织培养中，也是为了验证这个配方的通用性与有效性。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为百合黄精灵的鳞片，剥取自贵州省园艺研究所组培室的黄精灵组培苗，挑选生长势强的较大鳞茎采集。

1.2 方 法

1.2.1秋水仙素的配制

使用浓度为A:0.05%、B:0.075%、C:0.1%、D:0.125%、E:0.15%、F:0.175%、G:0.2%的秋水仙素溶液作为诱导剂，配制好的秋水仙素溶液贴好标签，121 ℃灭菌后待用。

1.2.2多倍体的诱导

取黄精灵组培苗鳞片，使用上述不同浓度的秋水仙素分别处理12、24、36、48、60、72 h，每个组合处理20个鳞片。处理完后的鳞片用无菌水清洗3次，每次浸泡10 min。接种到MS+蔗糖60 g·L-1+琼脂粉5 g·L-1+活性炭0.5 g·L-1+6-BA 0.3 mg·L-1，pH值5.8的培养基上培养。

1.2.3流式细胞仪鉴定多倍体

取从诱导鳞茎的底部分生出的小鳞茎幼嫩叶片3～4 mm，加裂解液200μL，用锋利的刀片快速切碎，加入1.5 mL的DAPI(4’6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐)暗染2～4 min，用30μm的滤网过滤到3 mL的玻璃管，流式细胞仪测定倍性。由于流式细胞仪主要使用叶片检测，因此主要针对于长出叶片的小鳞茎进行倍性检测。计算变异率时忽略处理死亡的鳞片，变异标准为能够在检测结果图像中看到明显的区别于二倍体的峰。

诱变率(%)=(变异鳞茎数/检测鳞茎数)×100%。

1.2.4多倍体根尖染色体观察

取变异的百合植株根尖1～2 cm，用0.7 mmol·L-1的放线菌酮室温处理4 h后，卡诺氏液(无水乙醇∶冰醋酸=3∶1)固定12 h以上备用，可较长时间保存。根尖进行观察前，先用0.5 mol·L-1的盐酸解离20 min，再用清水浸泡40 min，切取处理好的根尖分生区1～2 mm乳白色部分于载玻片上，滴1～2滴卡宝品红染色液染色12 min左右，盖上盖玻片后，橡皮擦敲击使根尖细胞散开，显微镜观察其染色体。

图1 百合鳞片褐化

2 结果与分析

2.1 秋水仙素诱导对材料的影响

培养30 d后，部分鳞片开始出现褐化死亡；50 d时，每个处理均有鳞片褐化死亡。死亡率最小的是0.05%处理12 h，仅有2个鳞片死亡，死亡率为10%，0.2%处理72 h的鳞片全部死亡。

由表1可知，在同一个处理时间，随秋水仙素处理浓度的增加，死亡率总体呈升高趋势。以12 h处理为例，从A浓度至G浓度，死亡率从10%上升至65%，虽然在F浓度略有下降，但是并没有改变总体上升的趋势。24、36、48、60 h处理总体与12 h处理相似，死亡率随着浓度的升高有明显的差异。

表1 秋水仙素诱导对百合鳞片的影响

秋水仙素浓度处理时间/h处理鳞片数/个死亡数/个死亡率/%A1220210B1220735C1220840D12201260E12201260F12201050G12201365A2420735B24201155C2420840D24201155E24201155F24201365G24201785A3620945B36201680C36201155D3620840E36201260F36201470G36201470A48201155B48201050C4820945D48201260E48201260F4820945G48201680A6020945B60201050C6020840D60201260E60201470F60201365G60201995A72201470B72201470C7220945D72201470E72201575F72201575G722020100

在相同处理浓度的情况下，不同的处理时间死亡率不同。以浓度A为例，从12 h至72 h的时间长度梯度处理中，死亡率逐渐由10%上升至70%，死亡率随着处理时间的加长呈明显的上升趋势，B、D、E、F、G与A相似。

综合来看，秋水仙素对植物的毒害作用随着处理浓度和处理时间的增加而加强，在G浓度72 h处理中死亡率达100%。

2.2 流式细胞仪检测植株倍性

在超净工作台中采集新生小鳞茎的叶片使用流式细胞仪检测其倍性。用二倍体黄精灵作为对照，取其叶片经流式细胞仪测定，结果如图2所示，按照流式细胞仪设计原理，四倍体黄精灵的信号峰应该出现在二倍体峰右侧，四倍体峰的x轴坐标值应等于二倍体峰x轴坐标值的2倍。

图2 黄精灵二倍体流式细胞仪图像

首先取浓度A处理12 h至72 h的所有材料进行检测，结果显示基本全部为二倍体，只有24 h的处理中出现了一个嵌合体，从四倍体峰的高度来判断，应该是秋水仙素起到了一定诱导效果(见图3)。检测结果表明，0.05%浓度的秋水仙素诱导效果较差。

依次对各个浓度的处理进行检测，0.075%的诱导效果和0.05%的诱导效果差异不大，在四倍体的位置虽有少量信号存在，数量很少，基本可以忽略(图4)。

0.1%浓度的秋水仙素处理效果较好，在24 h之后的处理时间上都得到了不错的诱导率，但得到的植株都是嵌合体。如图5所示，被检测植株是明显的二倍体与四倍体的嵌合体，有大量的二倍体细胞和四倍体细胞同时存在，这种情况在秋水仙素诱导百合鳞片产生多倍体中经常发生。另一方面，区别于根尖染色体数目观察的低采样率，流式细胞仪可以在短时间内对成千上万的大量细胞核进行核酸含量的检测，能够分辨每个植物细胞的倍性水平并从统计的角度反映植株整体的倍性分布状况，是一种高效而准确的检测方法。

图3 0.05%处理24 h流式细胞仪图像

图4 0.075%处理72 h流式细胞仪图像

浓度0.1%至0.2%的诱导效果都较好，容易得到变异植株，这些植株基本都是嵌合体，唯独在0.2%处理24 h中得到了1株较为纯净的四倍体，如图6所示。

从表2可见，秋水仙素的浓度对于诱导产生变异植株的概率有较大的影响，在较低浓度0.05%和0.075%水平上，虽然处理了较长时间，并没有得到很好的诱导效果。浓度从0.1%开始，取得了较好的诱导效果，其中0.1%处理48 h和0.125%处理60 h这2个组合都有较高的诱导率，分别为56%、55%。不过，也并不是处理浓度越高变异率就越高，0.1%、0.125%、0.15%3个浓度总体上诱导效果要优于0.175%和0.2%，但差异不大，2个最高的诱导率也出现在0.1%、0.125%浓度中。

表2 不同秋水仙素浓度与不同处理时间对黄精灵的诱变效果

秋水仙素浓度/%处理时间/h检测新生鳞茎数/个变异数/个变异率/%12140024101103611000.05486006050072400 12123252461173673430.1254884506011655725240121000247000.075366004880060600727001282252462333663500.15487343606233725120128002483293672170.148955660822572734312102202472293661170.17548113276072297251201252402431330.23662334821506010072000

从处理时间来看，也并不是时间越长，变异率就越高，综合来看，36 h和48 h在不同浓度上都有较好的诱导效果。

获得四倍体以嵌合体居多，这些嵌合体很可能在生长中逐渐恢复为二倍体，这在多倍体诱导中经常发生。试验中，只有0.2%处理24 h组合得到了1株较为纯净的四倍体。由于获得的纯净四倍体较少，很难说明这是否与浓度有相关性，或者只是单纯的概率问题，这点还需深入研究。

图5 0.1%处理24 h检测图像

图6 四倍体图像

2.3 变异植株染色体的观察

对检测出的四倍体植株根尖进行压片观察，发现染色体数量远远超过正常二倍体染色体数2 n=2 x=24(图8 a)，详细辨认后发现，四倍体细胞染色体数为2 n=4 x=48(图8 b)。

3 讨 论

试验中，虽然秋水仙素处理过的鳞片被清洗3次才转接到培养基上生长，但清洗浸泡时间有限，鳞片很难将秋水仙素完全排出，其后的培养过程中，这些鳞片不断地向培养基中排出剧毒的秋水仙素，这很可能影响了新生鳞茎的生长，造成部分小鳞茎生长势弱乃至死亡，以此推测，经常更换培养基可以有效提高新生鳞茎的生长，还需进一步验证。此外，试验验证了培养基配方的有效性，所使用培养基配方为试验室用于东方百合组培快繁的专用配方，基本满足了试验材料的生长及不定芽的增殖，取得了较好的效果，但是依然有进一步优化的余地。

图7 处理鳞片新生小鳞茎

图8 百合根尖染色体数

百合作为花卉用于商品生产已经有100多年的历史，此前主要的育种工作由美国和荷兰完成，他们通过野生种的杂交选育，逐渐形成了当下8个商业品种杂交系的格局。以黄精灵为例，其由东方百合与喇叭百合杂交得到，这属于亲缘关系较远的远缘杂交，这种远缘杂交策略被大量重复应用，形成了新的OT杂交系，归于8个杂交系中的“其他类型(Miscellaneoushybrids)”。目前，通过远缘杂交获得新品种的做法已经在百合育种领域成为主流，最新出现的LO、LA两个杂交系既是利用麝香百合分别与东方百合、亚洲百合杂交获得的，通过这些工作，诞生了大量远缘杂交新品种，为进一步的育种工作提供了新的种质资源，在使用这些新品种进行杂交育种方面，多倍体诱导技术拥有广泛的应用前景，对于克服其不育性与受精前障碍都有很大的帮助。