山东省部分地区猪伪狂犬病病毒分离鉴定及TK基因遗传变异分析

古金元，刘照虎，马梓承，李 焱，孟凡亮，王宏宇，肖一红，刘思当

（1.山东农业大学动物科技学院，泰安271018；2. 山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室，泰安271018；3.山东省畜禽疫病防制工程技术研究中心，泰安 271018）

伪狂犬病（Pseudorabies，PR）又称Aujeszky's disease（AD），是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的急性传染病，猪是其天然贮存宿主[1]。当前，猪伪狂犬病在全世界广泛流行，尤其是养殖密度较大的国家。PR可以造成种猪繁殖障碍，新生仔猪神经症状以及急性死亡，生长猪以及育肥猪出现呼吸道症状等，是目前威胁养猪业最主要的传染病之一，每年给全球养猪业造成无法估量的经济损失[2,3]。

胸苷激酶（thymidine kinase，TK）基因，是一种由病毒基因组编码的介导核酸代谢的酶类，主要决定着病毒的毒力强弱，是疱疹病毒中最早被发现的与毒力有关的基因，处于UL23区，基因全长963 bp，共编码321个氨基酸。TK基因的主要功能是催化脱氧胸腺嘧啶核苷磷酸化成dTMP，并继续磷酸化成DNA的基本成分dTTP。Kit等[4]率先确认了TK基因与PRV毒力有关。TK作为PRV重要的毒力基因之一，与病毒在机体神经组织中的复制，长期处于潜伏感染和激活处于潜伏感染状态的病毒粒子等过程关系密切，而与病毒在细胞内的增殖关系不大[5-7]。TK基因的缺失不但能造成PRV毒力明显下降甚至丢失，而且还可以大大减弱PRV在神经组织中的复制能力，由外周神经向脑传播的能力以及导致宿主脑炎死亡的能力。另外，TK基因缺失后的病毒在细胞上的增殖能力与野毒株没有显著的差异，但毒力及潜伏感染的能力却极大地减弱[8]。

2011年以前，基因缺失疫苗的普遍应用，结合gE-ELISA鉴别诊断方法的运用, PR在我国得到了有效的控制。但自2011年下半年开始，我国部分省市使用PRV传统疫苗免疫的猪群相继暴发疑似伪狂犬病疫情，发病率和病死率明显上升，并陆续分离得到病毒[9-15]。研究表明，分离毒株抗原性与传统毒株相比发生显著变异，PRV传统疫苗免疫后诱导产生的抗体，不能有效中和新分离病毒株，从而无法对猪形成完全的保护[14,16,17]。关于PRV变异毒株的分离报道越来越多，对其研究也日趋成为热点。

为了解山东省部分地区免疫猪场PR流行情况，本研究对2018年1～5月份采集到的PR疑似病料进行了病毒分离鉴定，并对PRV分离毒株TK基因进行了序列测定及遗传变异分析。

1 材料和方法

1.1 病料来源分别于2018年1～5月份在山东省济宁市、聊城市、临沂市、泰安市、德州市、淄博市等不同猪场，采集到10份PR疑似病料（脑组织、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、淋巴结、扁桃体），这些猪场均使用PRV疫苗进行了常规免疫。

1.2 主要实验材料pMD18-T Simple Vector、DL2000 DNA Marker、2×GC buffer、dNTP、rTaq酶、ddH2O购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司；Easy Pure Viral RNA/DNA Extraction kit、DH5α感受态细胞、胎牛血清（FBS）购自北京全式金生物技术有限公司；DMEM培养基购自HyClone公司；胶回收试剂盒（DNA Gel Extraction Kit）购自天根试剂公司；琼脂糖（Agarose）购自Sigma试剂公司；BHK-21细胞由本实验室冻存。

1.3 引物设计根据GenBank中登录的PRV TK全基因序列，使用Primer Premier 5.0引物设计软件设计1对引物，用于TK全基因扩增和序列分析，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列见表1。

1.4 病原检测将冻存于液氮中的病料组织解冻，取适量加入灭菌PBS研磨成匀浆，反复冻融3次后，9000×g离心3 min，然后取上清使用北京全式金EasyPure Viral DNA/RNA Extraction kit（批号：K10314）提取病毒核酸。将提取的核酸为模板，用PRV TK引物进行PCR，然后将扩增产物于1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，最后在紫外凝胶成像仪下根据条带位置判断病原的感染情况。

表1 PRV TK基因引物序列Table 1 Primer sequence of PRV TK gene

1.5 病毒分离及PRV TK基因序列分析将经过PCR鉴定为PRV TK阳性的病料匀浆液上清经0.22 μm滤器过滤后，接种于密度约70%的单层BHK-21细胞，盲传3代后收毒，将细胞及上清按上述方法提取核酸后，进行PCR鉴定。将鉴定为阳性的核酸利用PRV TK引物，进行TK基因全长的扩增。将扩增产物进行胶回收，连接pMD 18-T载体后转化至DH5α感受态细胞进行增菌培养，最后将鉴定为TK基因阳性的菌液送到上海生工生物公司测序。利用DNAStar 7.1软件对本研究中分离到的毒株和GenBank中录入的PRV参考毒株的TK基因进行核苷酸序列及推导氨基酸序列的比对分析，以便得出分离毒株的序列特征。同时构建TK基因遗传进化树，比较分离株与参考株亲缘关系的远近。本研究所用到的GenBank收录的13株参考毒株见表2。

表2 本研究序列分析所用参考毒株Table 2 PRV reference strains used for comparison in this study

2 结果与讨论

2.1 PR疑似病料病原检测结果对10份来自山东省不同地区的PR疑似病料用PRV TK引物进行PCR扩增，结果全部为阳性。

2.2 病毒的分离鉴定10份PRV TK阳性病料匀浆液上清经0.22μm滤器过滤后，接种于长满单层的BHK-21细胞，其中7份可见典型的PRV细胞病变，以细胞圆缩、聚集和脱落为主要特征。盲传3代后收毒，经PCR鉴定全部为PRV阳性。将7株PRV分别命名为SDDZ、SDHZ、SDJN、SDLC、SDLY、SDTA、SDZB。

2.3 TK基因的扩增及同源性分析TK基因扩增结果表明，7株PRV分离株TK基因全长均为963 bp。同源性分析结果显示，分离株之间TK基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为99.1%～99.8%和98.7%～99.4%，与参考毒株TK基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97.8%～99.9%和97.2%～99.7%，并且7株分离株与国内报道的PRV变异株的核苷酸和氨基酸序列的同源性均略高于欧美毒株。分离株与参考毒株TK基因核苷酸及推导氨基酸序列的同源性结果见表3。

2.4 PRV TK基因核苷酸及氨基酸序列分析使用DNAStar软件的MegAlign功能，对7株PRV分离株TK基因与国内变异株及欧美参考株Kaplan（JF797218）、Becker（JF797218）等进行分析比较，发现分离株及国内变异株与欧美参考株相比，有一个共同的规律，即在碱基第644-645位由AC突变为GT(图1A)，导致其氨基酸第215位由苏氨酸（T）突变为缬氨酸（V）(图1B)，结果表明7株分离株均应属于PRV变异毒株。

表3 分离株与各参考毒株TK基因核苷酸(nt)及推导氨基酸(aa)序列的相似度Table 3 Nucleotide and amino acid similarities of TK gene between isolates and reference strains

图1 PRV TK基因核苷酸（A）及氨基酸(B)分析比较Fig.1 Analysis and comparison of nucleotide （A）and amino acid (B) of TK gene

2.5 PRV TK基因的遗传进化分析将获得的7株PRV毒株的TK基因与GenBank已发表的13株参考毒株的TK基因进行核苷酸序列比对，利用MEGA6的Maximum-Likelihood方法构建进化树，结果见图2。

本研究分离到的7株毒株（标识）TK基因分别与国内之前报道的JS-2012、HeN2012、TJ2012以及ZMD2012等变异株（标识）位于两个相对独立的分支上，亲缘关系较近，而都与NIA3、Becker等欧美毒株以及疫苗株Hungary 2011（Bartha-K61株）（标识）的遗传距离较远。因此，我们推测目前山东省流行的PRV以变异毒株为主。当前国内关于PRV新流行毒株变异主要有3种观点：毒力增强说、抗原变异说以及毒力增强兼抗原变异说[18,19]。本研究中7株PRV变异株均分离自使用PRV传统疫苗常规免疫的猪场，表明目前广泛应用的疫苗株对PRV变异株的攻击已不能提供完全保护，这与之前国内很多研究报道的结论相一致：2011年之后PR的流行归结于PRV变异毒株的流行，而疫苗株无法提供有效保护[20-24]，但也有研究结果与之相悖[25]。

图2 分离株与参考株TK基因遗传进化树分析Fig.2 Phylogenetic tree of the nucleotide sequences of PRV isolates based on the TK gene