流感病毒先天性免疫机制研究进展

王 俊，史馨瑾，孙海伟，张文涛，陈鸿军

（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241；2.南京大学环境学院，南京210023）

流感病毒属于正黏病毒科，是一种含囊膜病毒，基因组由8个负链RNA片段组成，被核蛋白（NP）紧密包裹。血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）是流感病毒主要的糖蛋白，可由病毒抗体检测出，并据此确定病毒亚型。流感病毒可以感染多种宿主，包括猪、禽和人类。在大多数情况下，人类流感病毒感染限于呼吸道。通过口腔和鼻腔的流感病毒首先被覆盖在呼吸道上皮的粘液层阻挡，一旦病毒成功穿过粘液层，吸附并侵入呼吸道上皮细胞，病毒就可以定植、繁殖并扩散进入免疫细胞和非免疫细胞，例如巨噬细胞和树突状细胞。

先天性免疫系统对抵御流感病毒感染至关重要。不同类型的粘膜表面有特异的免疫系统来抵抗侵袭。被感染细胞内存在的病毒RNA被模式识别受体（pathogen associated molecular patterns，PRRs）识别，从而导致Ⅰ型干扰素（interferons，IFNs）、促炎性因子、促炎类花生酸和趋化因子的分泌。由巨噬细胞、肺泡上皮细胞、树突状细胞、浆细胞样树突状细胞合成的Ⅰ型干扰素刺激数百个干扰素刺激基因在邻近细胞中的表达，从而诱导抗病毒状态的出现。促炎性因子和促炎类花生酸可导致局部和全身炎症，引起发热和厌食，并指导对流感病毒的适应性免疫反应。感染部位产生的趋化因子会向气道招募更多种类的免疫细胞，如嗜中性粒细胞、单核细胞和自然杀伤性细胞（natural killer cell，NK）。NK靶向被病毒感染的上皮细胞，介导病毒清除。单核细胞和嗜中性粒细胞被迅速招募到流感病毒感染的肺部，与肺泡内巨噬细胞一同清除病毒感染的细胞[1,2]。

1 流感病毒感染的先天性识别

先天性免疫系统通过模式识别受体（PRRs）识别病原相关分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）来识别流感病毒感染。包括以下3种：①Toll样受体（toll-like receptor，TLR）：TLR3（识别感染细胞中的病毒双链RNA）[3]、TLR7（识别内含体中病毒单链RNA）、TLR8（识别内含体中病毒单链RNA）[4]；②视黄酸诱导基因I（retinoic acid-inducible I，RIG-I），识别5'-三磷酸RNA[5]；③NOD样受体家族成员：NOD-LRR-Pyrin结构域蛋白3（NLRP3），识别感染胞质中存在的病毒[6]。

1.1 Toll样受体介导的流感病毒识别TLR3可识别内含体中的双链RNA（dsRNA）。由于细胞RNA解旋酶UAP56（也称为剪接体RNA解旋酶DDX39B）的活性，流感病毒感染过程中并不产生dsRNA，因此，TLR3很可能识别流感病毒基因组中未知RNA结构。人呼吸道上皮细胞持续表达TLR3，激活后可诱导感染细胞产生促炎性因子，同时引起细胞病变。研究表明，致死性流感病毒感染后，TLR3-/-小鼠比野生型小鼠存活时间长，肺脏内趋化因子表达明显下调，白细胞和CD8+T细胞浸润明显减少[7]。以亚致死剂量流感病毒感染TLR3-/-小鼠时，体内可产生CD4+T细胞和CD8+T细胞应答，能正常产生抗体，表明该通路对T细胞免疫不是必需的[8]。因此，虽然TLR3能限制病毒的复制，但同时也招募了天然免疫和适应性免疫细胞，造成了宿主的损伤。在pDCs细胞中，TLR7识别进入内含体中的流感病毒基因组单链RNA，无需病毒复制。TLR7通过接头分子MYD88分别激活多种内含体转导通路、核转录因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）和干扰素调节因子7（interferon regulatory factor 7，IRF7），刺激促炎性因子和Ⅰ型干扰素分泌。同时，TLR7指导B细胞产生抗体对抗病毒发挥了重要作用。TLR8表达于单核细胞和巨噬细胞中，其配体也是单链RNA，可刺激细胞产生IL-12。

1.2 RIG-I识别感染细胞中复制的RNA对于已感染的细胞（通常是上皮细胞和肺泡巨噬细胞），RIG-I识别并诱导Ⅰ型干扰素产生是至关重要的[9]。RIG-I主要识别病毒复制后产生的带有5'三磷酸修饰的病毒双链RNA[5]。识别病毒RNA后，RIG-I的解旋酶结构域与ATP结合，从促进Caspase的构象改变，使Caspase的招募结构域能够与信号配体线粒体抗病毒信号蛋白（mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS）结合。流感病毒主要在细胞核内复制。迄今为止，RIG-I识别RNA准确位置尚不清楚。最近研究表明，RIG-I存在于抗病毒应激颗粒中，与病毒RNA和干扰素刺激诱导因子，例如丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白激酶R（protein kinase，PKR），共定位[10]。将抗病毒应激颗粒裂解后，RIG-I介导的IFN应答反应明显下调。PKR是抗病毒应激颗粒产生所必需的，病毒蛋白NS1可以通过劫持PKR来阻断抗病毒应激颗粒的形成。RIG-I识别通路在抗流感病毒过程中起着关键作用。

1.3 NLRP3炎性小体感知细胞损伤炎性小体的形成由多种刺激触发，包括宿主细胞膜损伤、病原感染或应激。源于多聚蛋白炎性小体复合物的NLRPs由一个NLRP（或其他PRRs）、配体ASC和前Caspase 1组成。炎性小体的激活导致前Caspase 1自催化加工形成活性形式，然后分别将前IL-1β和前IL-18切割为成熟分泌性IL-1β和IL-18。NLRP3表达于单核细胞、DCs、中性粒细胞和巨噬细胞等髓系细胞中，也可在支气管上皮细胞中表达。炎性小体需要双重信号被激活：信号1是由TLR、IL-1受体（IL-1R）和肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）介导的编码前IL-1β、前IL-18和NLRP3基因的转录和翻译[11]；信号2由宿主损伤诱导产生，可导致Caspase 1激活和自裂解，酶解产生成熟IL-1β和IL-18[12]。体内大部分信号1主要被共生菌激活，而信号2与流感病毒感染相关。信号2至少包括以下三种类型：①流感病毒的ssRNA足以激活THP1细胞释放IL-1β[13]；②通过流感病毒编码的基质蛋白2（M2）离子通道在高尔基体中级联激活NLRP3炎性小体的形成、前IL-1β和前IL-18的切割[14]；③在巨噬细胞溶酶体中，流感病毒毒力蛋白PB1-F2产生大分子聚集物刺激NLRP3炎性小体活化[15]。线粒体在流感病毒感染细胞NLRP3激活中起着重要作用。在巨噬细胞中，NLRP3激活需丝裂因子2参与形成炎性小体复合体，改变线粒体膜电位。在人支气管上皮细胞中，信号1（IL-1β和NLRP3mRNA的表达）的激活需要RIG-I依赖的Ⅰ型IFN表达，再通过激活Ⅰ型IFN受体（IFNAR）激活通路。在气道上皮细胞中，RIG-I还直接与ASC结合形成RIG-I-ASC-炎性小体复合物[16]。因此，流感病毒感染可刺激气道上皮细胞内NLRP3炎性小体的激活和气道上皮细胞中RIG-I炎症小体的激活。NLRP3炎性小体在流感病毒先天性免疫中至关重要，3对招募白细胞进入肺部必不可少。缺乏NLRP3、Caspase 1或IL-1R的小鼠均存在肺脏坏死和呼吸功能下降现象，且与野生型对照组相比，死亡率明显增加[17]。

2 干扰素刺激基因（interferon-stimulated genes，ISGs）抗流感病毒作用

对小鼠的遗传研究表明，包括MX蛋白、IFN诱导跨膜蛋白（interferon induced transmembrane protein，IFITM）和PKR在内的多个ISGs在限制流感病毒感染和传播方面具有不可或缺的作用。

MX蛋白是最早发现的流感病毒限制因子之一。在小鼠体内，MX1蛋白在细胞核中表达，能有效地阻止流感病毒感染，而MX2蛋白存在于胞浆中，却无抗流感病毒活性[18]。所有近交系小鼠都缺乏MX1和MX2功能。人受到IFNs刺激后表达MXA和MXB两种MX蛋白。MXA蛋白是胞浆蛋白，对A型流感病毒和许多其他病毒都有很强的抗病毒活性。而MXB蛋白存在于核孔复合体的胞质面。最近研究表明，MXB能抑制人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）感染，但不能抑制A型流感病毒感染[19]。

IFITM蛋白通过阻断病毒粘附和内吞作用后与宿主细胞膜的融合来限制大量病毒的复制[20]。其中，IFITM3由呼吸道上皮细胞、巨噬细胞和内皮细胞表达。IFITM3缺陷小鼠对流感病毒感染高度敏感。IFITM3缺陷小鼠与敲除整个Ifitm位点（即缺乏Ifitm1、Ifitm2、Ifitm3、Ifitm5和Ifitm6基因）的小鼠一样容易感染流感病毒[21]，这说明IFITM3在抵抗流感病毒感染中是一个关键因素。

2', 5'-寡腺苷酸合酶（2', 5' oligoadenylate synthetase，OAS）家族和核糖核酸酶L（RNase L）共同作用降解细胞内的病毒RNA。结合双链RNA后，OAS催化ATP转化成2',5'-寡腺苷酸，激活潜在RNase L的第二信使。人和小鼠有4种OAS基因，每个基因又含多个剪接异构体。激活的RNase L降解病毒和细胞的单链RNA，从而抑制蛋白合成和病毒增殖。RNase L敲除小鼠对RNA病毒包括流感病毒的易感性明显增强[22]。

PKR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，磷酸化真核细胞翻译起始因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2α，EIF2α）的α亚基。PKR结合病毒dsRNA，抑制翻译，从而减少细胞和病毒蛋白合成，有效抑制病毒复制。此外，PKR还通过激活NF-κB抑制因子（IκB）在信号转导和转录调控过程中发挥作用。感染细胞中PKR的激活引起细胞凋亡、生长停止和自噬，抑制病毒复制和在宿主间的扩散。同时PKR还可以稳定IFN-α和IFN-β的mRNA，从而确保IFN蛋白的大量合成。PKR基因敲除小鼠对各种病毒包括流感病毒的易感性明显增加[23]。鉴于流感病毒感染并不产生dsRNA，因此推测在病毒感染期间，可能是RNA基因组末端之间形成的柄状二级结构刺激了PKR。

除了上述ISGs以外，还有其他ISGs也能够阻断流感病毒感染（表1）。例如：过表达单羧酸转运体1a（SLC16A1）、FAM46A、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶D2（PRKD2）、Mx1、Irf1、Ifitm2和Ifitm3等均可有效抑制流感病毒增殖。其中SLC16A1、FAM46A和PRKD2抑制病毒复制的机制尚不清楚。编码Viperin的基因（又称RSAD2）过表达，通过干扰病毒出芽过程中脂筏的形成，来阻断流感病毒释放。抗病毒ISG胆固醇25-羟化酶（Ch25H）是在IFN信号作用下表达的，通过阻断病毒融合而将胆固醇转化为可溶性25-羟基胆固醇（25-HC），广谱抑制有囊膜的病毒。TRIM22则是通过抑制病毒基因组组装发挥限制作用。ISG15是一种泛素样蛋白，可靶向新翻译的病毒蛋白，缺乏ISG15的小鼠对流感病毒和其他病毒更易感。

表1 目前已知的干扰素刺激基因[12,24]Table1 Interferon-stimulated genes (ISGs) that control influenza virus infection

3 免疫损伤和免疫耐受

宿主抗感染保护作用可通过增加宿主对感染源的抵抗力，或通过增加宿主对感染源的耐受性来实现。保护性先天免疫应答通过增强抗病毒活性和/或增加耐受性来缓解疾病，而致病性先天性免疫应答为了减少病原体数量，不惜对组织造成免疫损伤，对宿主健康会产生负面影响。本文将重点讨论参与这两种应答中的一些关键细胞因子和可溶性保护因子。

3.1 增强抵抗力的先天性免疫信号研究最深入的是通过增强抗病毒抵抗力来介导先天性免疫反应。I型IFN作为典型代表，诱导数百个ISGs作为效应物来限制病毒复制。I型IFNs还通过诱导颗粒酶B表达来增强CD8+T细胞的杀伤活性[25]。除了I型IFNs外，IFNγ（II型IFN）和IFNλ（Ⅲ型IFN家族成员）也有一定的抗病毒作用。通过IFNAR和IFNGR激活的信号通路诱导产生不同的ISGs。例如：MX和OAS蛋白主要由Ⅰ型IFN诱导产生，而不是Ⅱ型IFN。其他细胞因子也能通过招募白细胞发挥抗流感病毒作用。流感病毒感染的小鼠肺部释放粒细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF），促进粒细胞的招募和病毒清除。GM-CSF缺陷的小鼠对低剂量流感病毒高度易感[26]。先天免疫细胞因子，如IL-1、IL-6、IL-18（除IL-12）等都能通过增强获得性免疫应答来保护宿主。IL-1可诱导DCs从肺脏迁移至纵隔淋巴结[6]，IL-18促进CD8+T细胞产生IFNγ[27]，而IL-10则是在流感病毒感染的肺泡内产生。

3.2 调节疾病耐受性的先天免疫反应宿主的先天性免疫保护也会增加疾病耐受性。IL-33诱导肺内固有淋巴样细胞（innate lymphoid cells，ILCs）分泌促进组织修复反应的表皮生长因子家族成员之一—双向调节素（amphiregulin）[29]。ILCs通过诱导上皮修复而促进组织愈合。ILCs清除后并不影响流感病毒A/PR8/34株的病毒载量，但会导致肺脏功能受损和组织损伤增加[28]。转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是典型的免疫调节剂，几乎所有细胞都以潜伏的非活性形式表达。流感病毒NA可将潜在的TGF-β切割成活性形式，体内阻断TGF-β可增加2009大流感H1N1病毒或H5N1高致病性流感毒株对小鼠的致死率[29]。将表达TGF-β的真核质粒注入流感病毒感染的小鼠肺脏，可减少炎症反应。TGF-β可增加疾病耐受性，但同时也降低抗病毒抵抗力。另外，CD200R也介导了抗感染损伤机制。CD200R由肺泡巨噬细胞表达，通过与肺脏上皮细胞表达的CD200相互作用，抑制巨噬细胞的炎症反应。CD200敲除的小鼠在A/X-31（H3N2）流感病毒感染下，虽然病毒载量明显减少，但体内产生一氧化氮，炎症细胞浸润明显增加[30]。

与促进宿主耐受性相反的是，其他一些因子会破坏耐受性。BALB/c小鼠肺脏的γδT细胞迅速分泌IL-17A和IL-17F来应答流感病毒A/PR8/34毒株感染[31]。与野生型小鼠相比，IL-17R敲除小鼠体重减轻，中性粒细胞减少，组织轻度损伤，但病毒载量和T细胞的激活能力不受影响[31]。TNFR1敲除小鼠在感染H5N1高致病性流感病毒后，发病率显著降低，但病毒复制和传播未受到任何影响[32]。由此可见，IL-17和TNF促进了炎症反应，对疾病的耐受性丧失，对抵抗力无明显贡献，从而为临床干预提供了理想的靶对象。

4 对急性肺损伤的免疫防控

流感病毒感染的致命程度取决于病毒本身毒力和先天性免疫反应。高致病性流感病毒，如1918年H1N1亚型及H5N1亚型毒株，可感染宿主呼吸道，产生大量促炎因子，这是由病毒毒力、病毒复制力及宿主对病毒的先天免疫反应所致。除病毒相关的分子特征外，小鼠呼吸道感染灭活的H5N1禽流感病毒或人感染H5N1流感病毒后，肺脏内会产生氧化磷脂（OxPAPC）[33]。氧化磷脂刺激TLR4，导致感染小鼠急性肺脏损伤。对感染流感病毒的小鼠进行全面脂肪酶代谢分析发现，5-脂氧化酶代谢物在致病性流感病毒感染中占主导地位，而2,15-脂氧化酶产生的保护性代谢物明显减少[34]。

目前通用的免疫治疗策略，包括阿司匹林、他汀类药物、环氧化酶抑制剂、糖皮质激素等，均在治疗流感病毒感染导致的急性肺脏损伤中无效。治疗急性肺脏损伤可通过增加抗病毒抵抗力和减少由病毒或免疫系统介导的组织损伤。增加抵抗力的药物必须在感染早期进行治疗，且无炎症副作用。例如：重组I型干扰素可引起“流感样症状”，不能被用于治疗。磷脂扫描结果鉴定出Ω-3多不饱和脂肪酸衍生的脂质介质调节剂保护素D1，可通过阻止RNA核输出，从而抑制流感病毒复制。

减少炎症反应和免疫病理损伤的手段有很多。用腺病毒载体携带活性TGF-β能延迟小鼠感染H5N1禽流感病毒后的死亡时间，减少病毒载量[35]。使用TGF特异性抗体可减少肺脏炎性细胞的招募和减轻损伤程度。阻碍肺脏白细胞浸润，如导致致死性流感病毒感染相关基因特性的嗜中性粒细胞浸润。鞘氨醇1磷酸酯受体1（sphingosine 1 phosphate receptor 1，S1PR1，也称为S1P1）表达于淋巴细胞和内皮细胞，可控制淋巴细胞从淋巴结渗出。S1PR1的竞争性抑制剂能在流感病毒攻毒后，短暂地阻碍趋化因子在肺脏内皮细胞的表达，从而在不影响获得性免疫应答和病毒载量的情况下，使小鼠免受致死性流感病毒感染。此外，试图阻止TLR4依赖的炎症反应可减少流感病毒感染期间产生的氧化磷酸脂。在小鼠模型中，用TLR4阻断剂Eritoran（E5564）阻断TLR4，能够降低小鼠感染PR8病毒后的死亡率[36]。炎性小体激活的抑制剂MCC950能够有效减少肺脏的炎性渗出，并且增加小鼠感染流感病毒后的存活率[37]。最新研究表明，NAE1抑制剂MLN4929通过抑制CRL/NF-κB信号通路和前炎性因子的表达，可以减少流行性H1N1流感病毒造成的肺脏免疫损伤[38]。

增加宿主免疫耐受性也不失为一种策略。不同类型细胞的耐受力有很大差异，而循环系统和呼吸系统对病理损伤最易感，因此，如何保护呼吸道内皮细胞和上皮细胞免受流感病毒感染造成的病理损伤？这是优先要考虑的治疗方向。给予能增加组织保护和修复的因子，如血管内皮生长因子和表皮生长因子，来限制活性氧造成的损伤，已被证实对机体是有益的。重组人过氧化氢酶或乙酰香兰酮等肺脏内给药，也能降低活性氧的水平，并提供保护力。