2012～2017年猪瘟活疫苗中牛病毒性腹泻病毒检测情况

朱晓玮，王 艳，许秀梅，杨莉莉，尹秀凤

（南京天邦生物科技有限公司，南京 211102）

牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的，临床上以牛黏膜发炎、糜烂、坏死以及腹泻为特征的疾病[1]。BVDV属于黄病毒科（Flaviviridae）、瘟病毒属（Pestivirus），与猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、绵羊边界病毒（Border disease virus，BDV）同属，具有抗原相关性，在血清学上存在着交叉反应。中国BVDV流行已相当严重。由于BVDV感染T细胞可引起免疫抑制，如果不采取措施对牛病毒性腹泻进行及时防控，一旦BVDV强毒株或超强毒株在猪群内流行，再加上危害严重的猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒，将会对我国养猪业的发展造成很大影响[2]。使用BVDV污染的猪瘟疫苗免疫猪可导致其感染BVDV，引起类似于非典型猪瘟的发生。因此，带有BVDV抗原的血清和牛睾丸也不能用来培养CSFV。

猪瘟活疫苗BVDV污染在我国时有报道，若不能及时检测出疫苗中BVDV污染情况，会造成重大经济损失甚至会导致传染病的流行。本研究参考GenBank中BVDV和猪瘟兔化弱毒病毒（Hog cholera lapinized virus，HCLV）序列设计1对引物，利用PCR对HCLV和BVDV进行鉴别诊断，并对猪瘟生产所用的原辅材料、半抗原及成品进行BVDV检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和细胞 BVDV C24V毒株（2007.12.20 F10）购自中国兽药监察所；HCLV C株为南京天邦生物科技有限公司生产用种毒；MDBK细胞购自中国兽药监察所；牛睾丸细胞为南京天邦生物科技有限公司自备。

1.1.2 试剂 BVDV检测试剂盒购自中国兽药监察所；核酸提取试剂盒、RT-PCR反应试剂购自TaKaRa公司。

1.1.3 样品 2012～2017年江苏A血清（A）、B血清公司（B）及内蒙某血清公司（C）提供牛血清共4089份，牛睾丸152批；猪瘟各收次抗原1255份，本公司猪瘟成品苗114批。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR检测 PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，扩增片段长度为312 bp。按试剂盒操作说明和RT-PCR常规方法对样品进行核酸提取、反转录、扩增及电泳检测。

1.2.2 BVDV培养和鉴定 将BVDV C24V株接种至MDBK细胞单层，37℃、5% CO2继续培养72 h进行冻融收获，作为BVDV阳性对照。将MDBK铺96孔细胞板，长成单层后，接种RT-PCR检测为BVDV阳性样品和BVDV C24V株阳性对照，并设健康细胞阴性对照，37℃、5% CO2继续培养72 h，按《中国兽药典》猪瘟活疫苗外源病毒检测和BVDV检测试剂盒操作方法对样品进行鉴定。

2 结果与讨论

2.1 BVDV繁殖结果用BVDV试剂盒对接毒细胞和健康细胞处理后，荧光显微镜下观察。阳性毒株和阳性样品接种的细胞，细胞质中可以观察到特异性绿色荧光，而健康对照细胞和样品中含灭活的BVDV阳性样品接种的细胞，细胞质中无绿色荧光（图1）。

图1 BVDV细胞培养与鉴定结果Fig.1 Identification of BVDV by cell culture

2.2 样品RT-PCR检测结果PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，所检BVDV 核酸阳性样品和阳性对照在312 bp 附近出现特异性条带，而所检BVDV 核酸阴性样品则无目的条带（图2）。2012～2017年BVDV RT-PCR检测结果具体见表1和表2。

猪瘟活疫苗BVDV 污染在我国时有报道，若不能及时检测出疫苗中BVDV污染情况，会造成重大经济损失，甚至会导致传染病的流行。范学政等[3]报道猪瘟疫苗中BVDV的感染率为21.74%。2011年，叶兆美等[4]对四川省市售的猪繁殖与呼吸综合征疫苗和猪瘟疫苗进行了检测，结果10份猪瘟疫苗和9份猪繁殖与呼吸综合征疫苗中BVDV的污染率为10.53%。范仲鑫等[5]对湖南省内的48 个批次的猪瘟疫苗进行了BVDV检测，阳性率为18.75%。张志等[6]对14个省的猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征弱毒招标苗进行检测，有9份BVDV阳性。我国猪群中BVDV感染也相当严重。吴文辉等[7]在2007年和2008年对上海市奉贤地区疑似猪瘟样品及不同批次的猪瘟弱毒苗进行BVDV检测，发现两者的阳性率分别为35.1%和64.1%。2009年和2010年又对该地区及邻近区域的疑似猪瘟送检生猪样品进行检测，发现BVDV阳性率分别高达80.39%和80.72%[8]。2004～2007年，戴益民等[9]报道江西省猪群中BVDV 感染率为10%～15.8%[10]。宋永峰等在2006年利用RT-PCR对浙江等6个省市的43份猪病料进行检测，结果检出BVDV 阳性率达16.3%。梁晟等[11]对2010～2012年广西省部分地区猪病进行调查，结果表明BVDV的检出率为26.92%。2012 年闽西地区部分猪场的BVDV 阳性率高达94.4%，其中种猪、育肥猪、保育猪和仔猪的阳性率分别为38.5%、17.3%、2.1%和27.4%[12]。本调查结果显示，2012～2017年共检测4089头新生牛血清、152批新生牛牛睾丸、1255份猪瘟抗原、114批猪瘟疫苗，BVDV阳性数分别为115、34、78和2。

图2 RT-PCR扩增产物电泳检测Fig.2 Result of RT-PCR detection

表1 2012～2017年 BVDV RT-PCR检测情况Table 1 Detection of BVDV during 2012-2017 by RT-PCR

表2 猪瘟疫苗生产用新生牛血清BVDV检测情况Table 2 Detection of BVDV in newborn bovine serum for the production of CSFV vaccine

目前猪瘟细胞苗生产中对BVDV病原的检测方法主要有细胞培养、免疫荧光染色及抑制试验等，但这些方法在实际中很难将CSFV和BVDV进行区分，而且耗时长，每次检测样本少，不利于生物制品原材料的快速检测。PCR敏感快速，每次检测的样本多，可用于BVDV牛血清的筛选。猪瘟原代细胞苗在生产过程中要用到牛血清、牛睾丸等牛源产品，原材料中若带有低滴度的BVDV，将会对猪瘟疫苗造成污染，进而对使用该疫苗的猪造成危害，对养殖业造成经济损失。

本研究中所用引物经过反复验证，对BVDV特异且敏感，无论活毒还是死毒都可检出。尽管死毒对疫苗的使用效果影响不大，但是本公司为了严格控制猪瘟疫苗质量，只要RT-PCR检出阳性，一律废弃。RT-PCR检测可用于猪瘟细胞苗全过程BVDV控制，或其他生产过程中用到牛血清的猪用活疫苗，如猪伪狂犬病活疫苗、猪蓝耳病弱毒活疫苗等。本研究中尽管对细胞培养用牛血清及牛睾丸进行了检测筛选，但在后面的半抗原和成品检测中仍有一定的阳性检出。有的是血清中失去活力的BVDV造成，如某批细胞的二收BVDV检测阳性，三收和四收BVDV检测结果却为阴性；有的是血清或牛睾丸中的活毒造成，如2016年的12份阳性样品，分别为07批、15批和19批3批细胞的1～4收次收获液。如果牛睾丸细胞中存在BVDV活毒，该批细胞则无法繁殖猪瘟病毒，用荧光定量PCR检测不到猪瘟病毒。《中国药典》三部（2010版）附录也对新生牛血清检测提出了相同的技术要求[13]。虽然各国对于牛血清的生产均有严格的技术规范，但由于检测技术存在局限性，市场上的牛血清还是存在BVDV污染的现象。本研究所测牛血清样品均为血清公司提供的经过检测的专门用于猪瘟病毒培养的血清。江苏两个血清公司提供的新生牛血清BVDV阳性率仍然为2.1%～4.97%，牛睾丸BVDV阳性率为30%左右，这也同时证明BVDV在江苏省牛群中感染十分严重。因此，本公司2016年后从内蒙某公司采购猪瘟专用新生牛血清和牛睾丸，保证了产品质量。另外，大品牌的血清也要坚持检测，本研究检测2批进口胎牛血清，结果1批BVDV阳性；检测3批进口小牛血清，其中2批BVDV阳性（表略）。张强等[14]采用RT-PCR检测进口胎牛血清，9份中有7份阳性。王竞晗等[15]从进口胎牛血清中成功分离到致细胞病变的BVDV FBS2014株。这些数据均说明进口胎牛血清BVDV阳性率相当高。

总之，为保证生物制品安全，所有原辅材料和最终产品都必需检测潜在污染物。疫苗生产企业必须严格按照GMP规范组织生产，对疫苗生产全过程进行质量控制，重点加强对原辅材料质量控制，制定严格的内控质量标准，认真开展原辅材料入厂检测工作[16]。