利用基于单链抗体的ELISA检测蔬菜中杀螟松残留

罗义辉　陈佳　徐金娥

摘要：为建立蔬菜中杀螟松残留快速检测方法，首先测定前期通过核糖体展示筛选所获得的抗杀螟松单链抗体的亲和力以及该抗体与其他有机磷农药的交叉反应率，然后建立基于该抗体的酶联免疫分析（ELISA）测定实际蔬菜样品中杀螟松残留的方法。研究表明：单链抗体ScFv-AF132与杀螟松的解离平衡常数为2.66×10-10 mol/L，与其他有机磷农药的交叉反应率≤0.17%。测得3种重庆市市售蔬菜的杀螟松残留，分别为0.532、0.004 21、0.235 mg/kg。样本添加回收率试验显示，平均回收率介于90.3%～112.8%，RSD（相对标准差）≤2.26%，说明本方法可靠，能在实际蔬菜样品杀螟松残留的快速检测中得到应用。

关键词：杀螟松;有机磷检测;单链抗体;ELISA;交叉反应率;回收率;残留;回收率

中图分类号： O657.71文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）19-0200-03

收稿日期：2018-07-18

基金项目：国家质量监督检验检疫总局公益性行业科研专项（编号：2012104003）。

作者简介：罗义辉（1966—），男，四川武胜人，博士，讲师，主要从事有害化学品快速检测研究。E-mail：383620115@qq.com。

通信作者：徐金娥，硕士，讲师，主要从事图书出版与生物信息学研究。E-mail：915847121@qq.com。

杀螟松又名杀螟硫磷，化学名称为O，O-二甲基-O-（3-甲基-4-硝基苯基）硫代磷酸酯，是常用的有机磷杀虫剂之一，毒性中等。有机磷杀虫剂广泛用于农业生产，因为它具有高活性、易降解等优点。同时，农产品中有机磷杀虫剂等农药残留对人们健康的影响也引人关注[1-2]。目前，对有机磷杀虫剂的检测一般采用色谱法，如气相色谱、薄层色谱、高效液相色谱等，这些方法的明显不足是样品准备程序复杂、劳动强度大、成本较高等，尤其不太适用于对蔬菜等需要保鲜的农产品的检测[3]。而以酶联免疫分析（ELISA）为代表的免疫检测技术由于具有高灵敏度、简单快速和廉价等优点，近年来已成重要的农残检测手段。

单链抗体（ScFv）是一种重组抗体，通过基因重组与表达获得[4-5]。与多克隆抗体相比，单链抗体具有与抗原更强的结合力;而与单克隆抗体相比，单链抗体具有生产成本低的优点，单链抗体因此在医学领域得到广泛应用[6-7]。而将单链抗体用于农药残留检测的研究较少[8-10]。本研究基于前期研究[9]通过基因重组、筛选及表达等技术所得到的单链抗体与ELISA相结合，首次建立了基于单链抗体的ELISA检测蔬菜中农药残留的快速检测方法，为快速检测农药残留提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

仪器与试剂：杀螟松等有机磷农药标准品，购自国家标准物质中心;Model 550酶标仪，购自Bio-Rad公司;卵清白蛋白（OVA）HisLinkTM蛋白纯化系统，购自Promega公司;HEPES缓冲溶液、BIAcore X系统、CM5芯片，购自通用电气（GE）公司。

蔬菜样品：蔬菜样品购于重庆市陈家桥菜市场。

1.2 单链抗体亲和力分析

将杀螟松-OVA（筛选抗原）与BIAcore专用CM5芯片偶联后置于BIAcore X系统中，分别将前期研究通过3轮核糖体展示技术从小鼠的抗体基因文库筛选所获得3株ScFv抗体蛋白以及原始文库（未经筛选）随机选取的抗体蛋白（小鼠血清）注入BIAcore X，流经固定有筛选抗原的CM5芯片表面，记录杀螟松-OVA与抗体蛋白结合过程。

1.3 单链抗体特异性分析

用竞争酶联免疫分析（IC-ELISA）测定3株抗体蛋白（ScFv-AF50 、ScFv-AF93和ScFv-AF132）与5种常用有机磷农药的交叉反应率来说明抗体蛋白对杀螟松结合的特异性。

竞争酶联免疫分析按经典步骤操作[11]（2步之间均弃上步溶液，并用含0.05% Tween 20的磷酸盐缓冲液洗板3次）：（1）包被。用质量浓度为20 μg/mL的单链抗体100 μL/孔，做3个平行，4 ℃过夜。（2）封闭。用1%明胶100 μL/孔，37 ℃ 放置2 h。（3）结合。用5种常用的有机磷农药（杀螟松、甲胺磷、甲拌磷、二溴磷、敌敌畏）梯度稀释液，50 μL/孔，37 ℃放置1 h。（4）加筛选抗原杀螟松-OVA，质量浓度为100 μg/mL，50 μL/孔，37 ℃放置1 h。（5）加二抗。用抗OVA抗体（辣根过氧化物酶标记），100 μL/孔，37 ℃放置 2 h。（6）显色。加底物100 μL/孔，暗處显色5～15 min，用 2 mol/L 硫酸终止显色，酶标仪读取D450 nm。

交叉反应率的获得：首先通过绘制标准曲线求不同有机磷农药的半抑制浓度IC50，标准曲线横坐标为有机磷浓度的常用对数，纵坐标为结合率（B/B0，B为梯度浓度的有机磷的D450 nm，B0为不加有机磷的D450 nm）。然后利用下式计算抗体蛋白对不同有机磷农药的交叉反应率[12]：

交叉反应率（CR）=[SX（]杀螟松的IC50其他有机磷的IC50[SX）]×100%。

1.4 蔬菜中杀螟松残留的测定

蔬菜样品前处理：将从普通农贸市场购买的蔬菜样品（甘蓝、黄瓜、莴笋）捣碎，称取10.00 g，用30 mL丙酮浸泡，室温下振荡30 min，离心分离，滤去残渣，滤渣用25 mL丙酮洗涤3次，合并滤液，用旋转蒸发仪蒸去丙酮，用100 mL磷酸盐缓冲液溶解待用。

蔬菜样品杀螟松残留的测定：利用竞争酶联免疫分析测定杀螟松，步骤与“1.3”节中交叉反应率测定相同，只是在第3步结合时加入的是浓度梯度 （0、1、2、4、8、16 ng/mL） 杀螟松标准溶液或样品处理所得溶液。用杀螟松标准溶液读取的D450 nm值建立标准曲线，用内插法先求得溶液中杀螟松浓度，再求算蔬菜中杀螟松含量。

1.5 样本添加回收率试验

向蔬菜样品（甘蓝、黄瓜、莴笋）各加入梯度量的杀螟松（0.10、1.00、10.00 mg/kg），4 ℃放置过夜，然后以“1.4”节中同样的方法对杀螟松残留进行提取、测定，计算回收率。

2 结果与分析

2.1 高亲和力抗体

作为对比，笔者测定了从原始文库中随机挑取9个抗体蛋白和筛选后获得的3个单链抗体蛋白与杀螟松-OVA结合，所得结果如图1所示。图1中横坐标为时间，纵坐标为响应值（RU），由于本试验所用的CM5芯片已经耦合了筛选抗原杀螟松-OVA，RU升高即显示有物质与筛选抗原结合。

图1-A中0～120 s是样品流经芯片的时间，RU无明显变化，说明这9个单链抗体蛋白几乎不与杀螟松-OVA结合。而经核糖体展示筛选后的单链抗体部分与杀螟松-OVA有结合，其中有3株与杀螟松-OVA结合较强（图1-B），图1-B中0～120 s的RU升高了300～700，说明筛选所获得的3个抗体蛋白与杀螟松-OVA有较强地结合，120 s之后RU降低，表示在进样结束后，缓冲液继续流经芯片将部分抗体蛋白洗脱下来。

为了测定抗体蛋白与杀螟松的亲和力，将3株ScFv抗体蛋白进行梯度稀释（8、4、2、1 nmol/L），利用BIAcore测定梯度浓度的单链抗体蛋白与杀螟松-OVA的结合-解离过程，再利用BIAcore evaluation软件对结合-解离曲线进行数据拟合以求算3株抗体蛋白的解离平衡常数，3株单链抗体（ScFv-AF50 、ScFv-AF93和ScFv-AF132）解离平衡常数分别为4.56×10-10、1.42×10-9、2.66×10-10 mol/L，解离平衡常数越小，说明抗体与抗原亲和力越强。其中，解离速率最小的单链抗体ScFv-AF132被选为下一步的试验。

2.2 抗体的特异性

利用竞争ELISA测定了单链抗体ScFv-AF132的选择性：分别以有机磷质量浓度的对数lgC、结合率B/B0为横坐标、纵坐标绘制结合标准曲线，图2是单链抗体ScFv-AF132对杀螟松的结合标准曲线。

通过该结合标准曲线可获得杀螟松对单链抗体ScFv-AF132的半抑制浓度IC50为1.6 ng/mL，再通过不同有机磷农药的半抑制浓度IC50计算交叉反应率（表2），作为对比，笔者也测定了小鼠血清（多克隆抗体）对有机磷的交叉反应率。从表2可以看出，3株抗体蛋白与其他有机磷农药的交叉反应率≤0.17%，而小鼠血清其他有机磷农药交叉反应率≤7.6%，说明筛选提高了抗体对杀螟松的特异性。

2.3 蔬菜中杀螟松的测定

利用IC-ELISA来测定蔬菜中的杀螟松。先建立标准曲线：横坐标为杀螟松浓度，纵坐标为与之对应的D450nm（加入不同浓度杀螟松与杀螟松浓度为0时的D450 nm之差），结果如图3所示。

通过标准曲线的数据拟合可得到回归方程：D450 nm=0.169C+0.012，先通过测定蔬菜提取液与空白液的D450 nm值，再利用回归方程测定提取液中杀螟松浓度，最后得到3种蔬菜样品中杀螟松残留，结果如表3所示。

从表3可以看出，本次测定的3种样品中均有一定的杀螟松残留，黄瓜中杀螟松残留最少，甘蓝中的残留量最高，而国家标准对上述3种蔬菜中杀螟松的残留量均 ≤0.5 mg/kg（《食品中農药最大残留限量》GB 2763—2014）[13]，可见本次测定的甘蓝样品中杀螟松残留超标，黄瓜、莴笋中杀螟松残留低于国家标准。但是，由于本试验属于小样本取样，蔬菜样品中农药残留是否超标还须进一步的试验验证。

2.4 样品添加回收率

分别向3种新鲜蔬菜中添加浓度梯度（0.10、1.0、10 mg/kg）的杀螟松，进行样品添加回收率试验以检验本方法的精密度，测定结果如表4所示。

从表4可以看出，本试验的平均回收率介于90.3%～112.8%，RSD（相对标准差）≤2.26%，说明本方法可靠，能在实际蔬菜样品杀螟松残留的快速检测中得到应用。

3 结论与讨论

本研究初步建立了基于单链抗体的竞争ELISA测定实际蔬菜样品中杀螟松的方法，利用该方法测得3种市售蔬菜（甘蓝、黄瓜、莴笋）的杀螟松残留量，分别为0.532 00、0.004 21、0.235 00 mg/kg。与农残标准对比可知，甘蓝样品中杀螟松残留超标，黄瓜、莴笋中杀螟松残留低于国家标准。样本添加回收率试验显示，平均回收率介于90.3%～112.8%，RSD≤2.26%，说明本方法可靠，能在实际蔬菜样品中杀螟松残留的快速检中得到应用。

由于竞争ELISA具有低成本、无需大型设备且能批量检测等优点，已经成为农药残留快速检测的主要方法之一，已有较多关于ELISA用于农药残留检测的报道，这些报道的ELISA往往基于多克隆抗体[14-18]或单克隆抗体[19-21]，多克隆抗体的缺点是特异性较差（本研究的交叉反应率的对比试验也说明了这一点），且不同动物、不同批次免疫所产生的多克隆抗体的质量往往也差异明显。而单克隆抗体则特异性好，缺点是造价高，这是单克隆抗体的制备方法所决定的。本研究所使用的重组抗体具有单克隆抗体高亲和力、高特异性的优点，若批量生产，则较单克隆抗体廉价。当然，重组抗体的前期投入较高，如cDNA文库的构建、核糖体展示筛选单链抗体等。笔者所在的课题组也曾建立了基于单链抗体的BIAcore测定蔬菜中杀螟松残留的方法[12]，2个方法所得的结果相似。不同之处在于：利用BIAcore无须用二抗，但BIAcore系统设备较大，不适应田间、市场等现场操作;竞争ELISA须标记二抗，稳定性不如BIAcore，但适用于现场操作。若能将二者结合，根据不同的条件选择测定方案，才能使该方法走向实际应用。

参考文献：

[1]齐志彩. GC-MS检测蔬菜有机磷农药残留的效果分析[J]. 中国卫生检验杂志，2012，22（9）：2058-2060.

[2]马 琳，黄兰淇，陈建波，等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定草莓中19种农药残留量[J]. 分析测试学报，2016，35（6）：698-703.

[3]杨 眉，陈学敏，李 钰，等. 分子印迹传感技术在农药残留检测中的应用研究进展[J]. 农药学学报，2016，18（2）：151-157.

[4]詹屋强，黄宇婷，张瑾如，等. 抗克百威单链抗体的可溶性表达、纯化与鉴定[J]. 食品工业科技，2017，38（20）：77-82，89.

[5]Li T，Zhang Q，Liu Y，et al. Production of recombinant ScFv antibodies against methamidophos from a phage-dispaly library of a hyperimmunized mouse[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（24）：9085-9091.

[6]乔媛媛，陈宇萍. 单鏈抗体及其医学应用[J]. 中国生物制品学杂志，2009，22（1）：98-101.

[7]Yuan Q，Xia Y，Nian S，et al. Selection of single chain fragments against the phytopathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri by ribosome display[J]. Enzyme and Microbial Technology，2007，41：383-389

[8]罗义辉，罗天培. 抗有机磷农药单链抗体cDNA文库的构建与鉴定[J]. 河南农业科学，2014，43（5）：97-101.

[9]Luo Y H，Xia Y X. Selection of single-chain variable fragment antibodies against fenitrothion by ribosome display[J]. Analytical Biochemistry，2012，421（1）：130-137.

[10]周丽君，黄启欣，雷红涛，等. 二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药单链抗体的制备及广谱特异性[J]. 高等学校化学学报，2012，33（10）：2269-2274.

[11]刘凤权，王金生，许志刚，等. 利用间接竞争ELISA方法分析甲胺磷在稻田中的残留和流失[J]. 农业生物技术学报，1999，7（2）：135-139.

[12]刘 珊，罗义辉. 利用基于单链抗体的BIAcore技术检测蔬菜中的杀螟硫磷残留[J]. 河南农业科学，2017，46（5）：95-99.

[13]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，中华人民共和国农业农村部. 食品中农药最大残留限量：GB 2763—2014[S]. 北京：中国标准出版社，2014：151.

[14]韩丽君，贾明宏，钱传范，等. 甲基对硫磷的酶联免疫吸附分析（ELISA）研究[J]. 农业环境科学学报，2005，24（1）：187-190.

[15]Liu B，Ge Y，Zhang Y，et al. Production of the class-specific antibody and development of direct competitive ELISA for multi-residue detection of organophosphorus pesticides[J]. Food & Agricultural Immunology，2012，23（2）：157-168.

[16]Liang Y，Liu X J，Liu Y，et al. Synthesis of three haptens for the class-specific immunoassay of O，O-dimethyl organophosphorus pesticides and effect of hapten heterology on immunoassay sensitivity[J]. Analytica Chimica Acta，2008，615（2）：174-183.

[17]Hua X D，Yang J F，Wang L M，et al. Development of an enzyme linked immunosorbent assay and an immunochromatographic assay for detection of oranophosphorus pesticides in different agricultural products[J]. PLoS One，2012，7（12）：e53099.

[18]吴 刚，黄雅丽，朱国念，等. 有机磷杀虫剂毒死蜱的免疫化学分析方法研究[J]. 中国农业科学，2004，37（3）：382-386.

[19]刘运清，李岩松，乔 斌，等. 3种有机磷农药间接竞争ELISA检测方法的建立[J]. 农药，2017，56（10）：746-749，766.

[20]王 菡，李高华，陈 涛，等. 基于广谱性单克隆抗体免疫分析有机磷农药残留[J]. 食品安全质量检测学报，2015，6（11）：4399-4408.

[21]邹茹冰，柳 颖，王双节，等. 化学发光酶联免疫分析法同时检测3种有机磷农药残留[J]. 农药学学报，2017，19（1）：37-45.