麸皮曲鱼酱油的制备及品质分析

朱萌，钱晓庆，林成军，汪兰，熊光权，丁安子，王军

(1.湖北工业大学 生物工程与食品学院，武汉 430064；2.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所/湖北省农业科技创新中心，武汉 430064；3.荆州市皇冠调味品有限公司，湖北 荆州 434000)

鱼酱油，又称鱼露，其传统工艺是将低值鱼虾盐渍，经长达一年至几年的自然发酵，形成一种呈琥珀色泽、味道鲜咸的调味品，常用于闽菜、潮州菜和东南亚料理中。为缩短鱼酱油的发酵周期，多采用降盐法、保温法、加酶法和加曲法中的一种或多种方法，从而实现快速分解原料中蛋白质和脂肪、形成特有滋味和风味的目的。Klomklao等[1]通过调整盐和鲣鱼内脏的添加量制备沙丁鱼鱼酱油，研究发现减少食盐用量和添加金枪鱼内脏后，可显著提高蛋白质的降解速率以及鱼酱油的品质。黄紫燕等[2]采用前期高盐酶解、中期加曲自然发酵、后期高盐保温的速酿方式，使传统鱼酱油的发酵时间由3年缩短为1年。在速酿鱼酱油的生产方法中，加曲法所添加种曲的酶系较为全面，包含蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和糖化酶等，不仅可有效缩短发酵周期，其产品品质也较为优异，因而得到广泛应用。种曲常用原料有大豆、豆粕、大米、大麦、小麦和麸皮等。Murakami等[3]研究发现添加不同原料制备的种曲后，鱼酱油的鲜味均得到提高，其中大豆曲影响鱼酱油的口感，大米曲、大麦曲和小麦曲影响鱼酱油的风味，而麸皮曲对鱼酱油的品质影响尚未见报道。

本研究采用麸皮曲混合绞碎鱼肉发酵制备鱼酱油，并分析发酵过程中理化指标的变化。以游离氨基酸含量评价麸皮曲鱼酱油的滋味，以固相微萃取(SPME)结合气相色谱-质谱(GC-MS)双色谱柱定性分析评价麸皮曲鱼酱油的风味，为麸皮曲鱼酱油的工业化提供了实验基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

新鲜鳜鱼：4月份购于武汉白沙洲水产市场，条重(500±70) g，带水运输至实验室，宰杀后去鳞、去鳃、去内脏并冲洗。采用冷冻绞肉机将其绞碎，储存于-18 ℃冰箱中备用。

米曲霉(Aspergillusoryzae，沪酿3.042)：广东省微生物菌种保藏中心；麸皮、食盐、面粉等：武商量贩农科城店；2-甲基-3-庚酮：美国Sigma公司；其他试剂：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

L-8900氨基酸分析仪 日本Hitachi公司；57330-U SPME萃取装置、57348-U萃取头 美国Supelco公司；Trace 1310-ISQ LT/Trace Ultra DSQ Ⅱ LT气相色谱-质谱联用仪 美国Thermo Fisher公司。

1.3 实验方法

1.3.1 麸皮曲鱼酱油的制备

参考赵谋明等[4]的方法，并在前期研究基础上略做改动，麸皮∶面粉按4∶1混匀后于121 ℃灭菌15 min→接种0.05%米曲霉→培养44 h得麸皮曲→鱼泥∶麸皮曲∶盐∶水按1∶0.5∶0.55∶1.5搅拌均匀→控温30 ℃发酵180 d→100目过滤→90 ℃加热15 min→-18 ℃冰箱贮藏待测。

1.3.2 理化指标测定

参考倪海晴[5]的方法，分别在鱼酱油发酵过程的第5，10，20，30，60，90，120，150，180天取样进行理化指标测定。pH值、总酸、氨基酸态氮采用甲醛滴定法测定，还原糖采用比色法测定，游离氨基酸采用氨基酸自动分析仪测定。

1.3.3 挥发性风味物质分析

取发酵180 d的麸皮曲鱼酱油样品10 mL，置于50 mL样品瓶中，加入20 μL内标(2-甲基-3-庚酮)，50 ℃恒温水浴30 min至挥发性风味物质达到吸附-释放平衡。将老化处理后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头插入样品瓶中萃取40 min，然后将萃取头插入GC/MS进样器中解吸附5 min，进样口温度250 ℃。

色谱条件参考王娟等[6]的方法：DB-5MS弱极性毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，DB-WAX极性毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，载气为He，流速1 mL/min，不分流进样；采用程序升温：起始温度40 ℃，保持4 min，然后以3 ℃/min升温至100 ℃，保持10 min，再以6 ℃/min升温至150 ℃，保持8 min，最后以20 ℃/min升温至280 ℃，保持10 min。

质谱条件：传输线温度为280 ℃；离子源温度为250 ℃；电离方式为EI+；发射电流为200 μA；电子能量为70 eV；扫描质量范围为35～500 amu。

保留指数(RI)：在与样品相同色谱条件下，对C6～C33正构烷烃标准品进行GC-MS分析，通过公式(1)计算RI值。

(1)

式中：n和n+1为未知化合物前后正构烷烃碳原子数；t为未知化合物保留时间，tn和tn+1为相应正构烷烃保留时间(tn+1>t>tn)。

1.3.4 OAV的计算

采用NIST谱库检索、保留指数比对进行定性分析；根据内标物的质量浓度、内标物的峰面积与目标物的峰面积进行半定量分析。采用OAV值评价各挥发性风味物质对样品总体香气的贡献。

OAVi=Ci/Ti。

(2)

式中：Ci、Ti分别为各挥发性风味物质的含量(μg/kg)和相应的阈值(μg/kg)。

1.3.5 数据处理

采用Excel 2013进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中理化指标变化

发酵过程中，麸皮曲鱼酱油中氨基酸态氮含量变化见图1。

图1 发酵过程中氨基酸态氮含量的变化趋势Fig.1 The change trend of amino acid nitrogen content during fermentation

氨基酸态氮含量呈先增加后减少的趋势。从初始至第120天，鱼肉中蛋白质在麸皮曲中蛋白酶的作用下酶解生成大量含-NH2的游离氨基酸及小分子肽[7]，氨基酸态氮含量快速增加，由0.39 g/dL增加至0.78 g/dL，增幅达100%；从第120～180 d，随时间的增加以及pH的降低，蛋白酶逐渐失活，酶解出的游离氨基酸逐渐减少，而美拉德反应和嗜盐微生物代谢消耗的氨基酸逐渐增多[8]，氨基酸态氮含量逐渐减少，由0.78 g/dL减少至0.64 g/dL，减少了17.9%。

发酵过程中，麸皮曲鱼酱油中总酸(以乳酸计)、pH的变化见图2。

图2 发酵过程中总酸及pH的变化趋势Fig.2 The change trend of total acid content and pH during fermentation

总酸含量先增加后减少，从初始至第120天，总酸含量逐渐增加，由0.49 g/dL增至1.17 g/dL，随后逐渐减少至0.67 g/dL。pH与总酸含量呈相反变化趋势，先降低后升高，从初始至第120天，pH降低至5.32，然后升高至5.44。发酵前期，麸皮中碳水化合物在微生物的作用下生成各种有机酸(主要是乳酸)，鱼肉中的蛋白质在麸皮曲中蛋白酶的作用下分解成酸性多肽及氨基酸，鱼肉中脂肪水解出游离脂肪酸，从而引起总酸的增加，pH的减少。发酵后期，酯化反应消耗部分有机酸、脂肪酸[9]，美拉德反应和嗜盐微生物代谢消耗部分氨基酸，从而造成总酸的减少，pH的增加。

发酵过程中，麸皮曲鱼酱油中还原糖的变化见图3。

图3 发酵过程中还原糖含量的变化趋势Fig.3 The change trend of reducing sugar content during fermentation

还原糖呈先增加后波动减少的趋势。在制曲阶段，麸皮曲中米曲霉所产生的淀粉酶及糖化酶将淀粉酶解为还原糖，因而发酵初期还原糖即处于较高浓度。从初始至第30天，淀粉继续被酶解为还原糖，还原糖含量逐渐增加；30～60 d，还原糖一部分为嗜盐微生物增殖提供碳源，另一部分被嗜盐微生物转化为有机酸，还原糖含量迅速减少；60～180 d，淀粉酶和糖化酶继续分解淀粉/糊精生成还原糖，同时美拉德反应和嗜盐微生物生长消耗部分还原糖，从而造成还原糖含量波动减少。

2.2 发酵过程中游离氨基酸变化

发酵过程中，麸皮曲鱼酱油中游离氨基酸的变化见表1，呈梯度上升趋势。从初始至第20天，总游离氨基酸在麸皮曲中蛋白酶的作用下逐渐增加，由33.712 g/L增至47.938 g/L；20～60 d，酶解生成的游离氨基酸与嗜盐微生物增殖所消耗的氨基酸趋于平衡，总游离氨基酸无显著变化；60～90 d，增殖的嗜盐微生物所分泌的蛋白酶参与酶解，总游离氨基酸增加，由46.490 g/L增至52.671 g/L；90～180 d，酶解所产生的游离氨基酸与美拉德反应，嗜盐微生物代谢所消耗的游离氨基酸趋于平衡，总游离氨基酸无显著变化。

表1 发酵过程中氨基酸含量的变化Table 1 The change of amino acids content during fermentation

续 表

根据Tseng等[10]、Zhang等[11]对氨基酸滋味的描述，可分为鲜味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、甜味氨基酸(苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸)、苦味氨基酸(组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸)和无味氨基酸(赖氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)。发酵过程中，鲜味氨基酸持续增加，甜味氨基酸和苦味氨基酸与总游离氨基酸呈现相同的变化趋势，含量梯度上升，变化趋势与Wang等[12]对传统中式鱼露的研究结果以及高献礼[13]对高盐稀态酱油的研究结果一致，但各呈味氨基酸占比不同。本研究的麸皮曲鱼酱油中甜味氨基酸占42.51%(鱼露2.09%，酱油32.26%)，占比显著增加；苦味氨基酸占33.44%(鱼露41.43%，酱油54.78%)，占比显著减少；鲜味氨基酸占24.05%(鱼露34.05%，酱油12.58%)，占比低于鱼露高于酱油。较少的苦味氨基酸、较多的甜氨基酸以及鲜味肽、核苷酸和氯化钠的增效作用使麸皮曲鱼酱油呈强烈的鲜、咸、甜味，与感官体验结果一致[14-17]。原料中所包含的不同碳、氮源形成不同类型的嗜盐微生物群落以及差异化的美拉德反应途径，最终使麸皮曲鱼酱油呈现较佳的滋味、品质。

2.3 挥发性风味物质分析

同时采用2种不同极性的色谱柱(DB-5MS、DB-WAX)对麸皮曲鱼酱油中挥发性风味物质进行双柱定性，通过NIST谱库检索和RI值比对，共鉴定出挥发性风味物质58种，见表2。其中酸类12种，醛类11种，醇类9种，呋喃9种，酯类5种，酮类5种，含硫化合物3种，苯酚等其他化合物4种。由2种色谱柱鉴定结果分析可知，酸类、醇类化合物DB-WAX色谱柱鉴定数量多于DB-5MS色谱柱，醛类、酮类等化合物DB-WAX色谱柱鉴定数量少于DB-5 MS色谱柱，即极性色谱柱鉴定出更多的极性化合物，弱极性色谱柱鉴定出更多的弱极性化合物，符合相似相溶规律。因此，采用不同极性色谱柱进行双柱定性分析，其鉴定结果更加准确、全面。

表2 鱼酱油挥发性化合物GC-MS分析结果Table 2 GC-MS analysis results of volatile compounds in fish sauce

续 表

OAV值是挥发性风味物质浓度与其阈值的比值，广泛用于关键香气物质的筛选，OAV≥1则可认为此化合物为关键呈香化合物，OAV值越大，该化合物对整体香气的贡献程度越高。

表3 鱼酱油关键香气物质分析结果Table 3 Analysis results of key aroma substances in fish sauce

续 表

由表3可知，麸皮曲鱼酱油中关键香气物质有9种，分别为异戊醛(1093)、异戊醇(59.34)、3-甲硫基丙醛(40.96)、苯乙醛(7.48)、1-辛烯-3-醇(5.38)、壬醛(5.35)、二甲基三硫(4.5)、葵醛(3.9)和正己醇(1.86)。笔者对麸皮曲鱼酱油进行感官体验，发现鱼酱油呈麦芽香主导的酱味头香，体香以花香、甜香为主，残香类似鱼类脂肪香，与OAV结果一致。王悦齐等[22]对传统中式鱼露的研究表明，香气贡献程度较大的物质依次为：3-甲硫基丙醛(159.74)、异戊醛(129.71)、1-辛烯-3-醇(69.41)、2-甲基丙醛(21.08)、乙酸乙酯(19.06)等。冯云子[23]对高盐稀态酱油的研究表明，香气贡献程度较大的物质依次为：异戊醛(460)、HEMF(363)、乙酸乙酯(183)、2-甲基丁醛(167)、3-甲硫基丙醛(101)、2-甲基丙醛(80)、胡芦巴(43)、2-甲基丁醇(35)、苯乙醛(31)等。从关键香气组成比例及感官体验结果来看，麸皮曲鱼酱油与高盐稀态酱油更为相似。另外，冯云子的香气缺失实验还表明异戊醇、苯乙醛的缺失会导致形成差异显著的酱油香气模型，而异戊醇和苯乙醛在麸皮曲鱼酱油和高盐稀态酱油关键香气物质中的贡献均较大，在传统中式鱼露中的贡献较小，进一步说明产品命名为麸皮曲鱼酱油更为合适。

3 结论

本研究以麸皮和绞碎鱼肉控温发酵制备鱼酱油，在180 d的发酵过程中，氨基酸态氮和总酸均呈先增加后减少趋势，分别达0.64，0.67 g/dL；pH与总酸趋势正好相反，先减少后增加，至5.44；还原糖呈先增加后波动减少趋势，达1.56 g/dL。

游离氨基酸分析结果表明，麸皮曲鱼酱油总游离氨基酸达51.427 g/L，其中鲜味氨基酸占24.05%，甜味氨基酸占42.51%，苦味氨基酸占33.44%，较高盐稀态酱油和鱼露相比，具有更多的甜味氨基酸和更少的苦味氨基酸，呈现出较佳的滋味品质。采用SPME-GC/MS双色谱柱定性的方法对麸皮曲鱼酱油的挥发性风味物质进行分析，分析结果表明双柱定性分析的结果更加准确、全面。结合香气活性值(OAV)确定其关键香气物质为异戊醛、异戊醇、3-甲硫基丙醛、苯乙醛、1-辛烯-3-醇、壬醛、二甲基三硫、葵醛和正己醇。氨基酸分析和风味分析结果还表明，麸皮曲鱼酱油更类似于高盐稀态酱油，与感官体验一致。