核糖体蛋白RPL34-PS1对B细胞淋巴瘤的生长促进作用

周芳超，蒋 静，2，刘金晶，郁多男

(1.扬州大学 医学院，江苏 扬州 225001;2.扬州大学 转化医学研究院，江苏 扬州 225009)

淋巴瘤是起源于淋巴结和淋巴组织免疫系统的恶性肿瘤，淋巴瘤大致可分为非霍奇金淋巴瘤(90%)和霍奇金淋巴瘤(10%)。大多数淋巴瘤(90%)起源于B细胞，但也可能是T细胞或自然杀伤细胞[1]。B细胞淋巴瘤是B细胞发生的恶性实体肿瘤，涉及免疫球蛋白位点的染色体易位是许多B细胞淋巴瘤的标志。然而，其他例如环境因素DNA复制错误等也在B细胞恶性肿瘤的发病机制中起重要作用[2]。核糖体蛋白(ribosomal protein，RP)是核糖体的重要成分之一，它可以和RNA结合形成核糖体并起到合成蛋白质的作用。RP除了参与蛋白质的合成以外，还能够参与调控细胞增殖，凋亡和分化以及参与DNA的复制[3]，目前也有报道核糖体蛋白异常表达会导致恶性血液疾病[4]，同时部分核糖体蛋白也被报道能参与调控胃癌，但是对于核糖体蛋白与淋巴瘤之间的关系，目前尚无报道。本实验旨在证明一种核糖体蛋白RPL34具有显著促进B细胞淋巴瘤生长的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株和试剂

小鼠B淋巴瘤细胞(由本实验室组负责人郁多男教授构建)；Alph MEM细胞培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司)；Annexin V Alexa Fluor647/PI/Appotosis dection kit(南京福麦斯生物公司)；BrdU细胞周期检测试剂盒(美国BD生物公司)。

1.2 稳定过表达RPL34的B淋巴瘤细胞系构建

在pubmed上查询到RPL34的基因序列后，设计引物通过PCR的方法体外扩增RPL34的序列后，通过分子克隆将RPL34的序列插入逆转录病毒载体pBABE-Puro中，包装病毒并感染38B9细胞48 h后用0.6 μg/μL的嘌呤霉素连续筛选7 d即得到稳定表达RPL34的B淋巴瘤细胞系RPL34-38B9。

1.3 细胞计数

取对数生长期的RPL34-38B9及其对照组pBABE-38B9,细胞体外培养，连续计数4 d。

1.4 细胞周期

取对数生长期的RPL34-38B9及其对照组pBABE-38B9细胞，使用BD公司的BrdU细胞周期检测试剂盒检测细胞周期变化，具体步骤见产品说明书。

1.5 细胞凋亡

取对数生长期的RPL34-38B9及其对照组pBABE-38B9细胞，用PBS离心清洗后弃去上清，100 μL缓冲液重悬细胞。每管加入5 μL Annexin V和10 μL PI 染液染色后，避光孵育15 min后再加入400 μL缓冲液后用流式细胞仪(FACS Verse)检测。

1.6 H&E染色

取106对数生长期的RPL34-38B9细胞及其对照组pBABE-38B9细胞后，皮下注射到Balb/c小鼠体内，每组4只，成瘤后连续测量肿瘤大小[5]。

1.7 统计学分析

2 结果分析

2.1 核糖体蛋白RPL34能够显著提高38B9细胞的增殖能力

取相同浓度对数生长期的RPL34-38B9及其对照组pBABE-38B9细胞体外培养并连续计数4 d后发现，如图1结果显示，过表达核糖体蛋白RPL34能够显著提高38B9细胞的生长速度。

图1 RPL34在体外对38B9增殖能力的影响Fig 1 Effect of RPL34 on proliferation of 38B9 in vitro

2.2 核糖体蛋白RPL34能够通过增加细胞合成期加速细胞生长

取2×106对数生长期的RPL34-38B9及其对照组pBABE-38B9细胞，用PBS清洗一遍后，用70%乙醇冰上固定1 h后，加入破膜剂冰上孵育15 min后，加入PI和RNA酶A后Flow Cytometry分析发现，如图2所示,核糖体蛋白RPL34能够显著增加细胞S期，并且整个细胞周期中处于静息期外的细胞比例更高。

图2 RPL34对38B9细胞周期的影响Fig 2 Effect of RPL34 on cell cycle of 38B9 cells

2.3 核糖体蛋白RPL34能够减少38B9的凋亡

取105对数生长期的RPL34-38B9及其对照组pBABE-38B9细胞后，用PBS离心清洗后弃去上清，100 μL缓冲液重悬细胞。每管加入5 μL Annexin V和10 μL PI 染液染色后，避光孵育15 min后再加入400 μl缓冲液后Flow Cytometry分析,结果如图3所示,发现过表达RPL34能够减少细胞早凋和晚凋的比例，同时死细胞也有一定程度的减少。

2.4 核糖体蛋白RPL34能显著提高38B9细胞的成瘤能力

取106对数生长期的RPL34-38B9及其对照组pBABE-38B9的细胞注射入Balb/c小鼠腋下，每组4只，待第一只小鼠成瘤后开始测量肿瘤大小，每隔2～3 d测量一次，肿瘤体积结果如图4a所示，取第11 d肿瘤称重后结果如图4b所示。由图4可知，核糖体蛋白RPL34能够显著增强38B9细胞的成瘤能力。

图3 RPL34对38B9细胞凋亡的影响Fig 3 Effect of RPL34 on apoptosis of 38B9 cells

图4 RPL34对38B9细胞成瘤能力的影响Fig 4 Effect of RPL34 on tumorigenesis of 38B9 cells

3 讨论

核糖体作为蛋白质合成的场所，在细胞发育生长的过程中发挥着多种重要的功能。核糖体蛋白作为核糖体重要的组成成分，它的异常表达会阻碍核糖体的正常组装和功能发挥，从而影响细胞的生物合成功能;同时由于核糖体蛋白具有核糖体外功能，其异常将进一步影响细胞的生物学功能，进而引起疾病的病理生理学改变[10]。

近年来的研究已经发现核糖体蛋白的异常与一些恶性肿瘤或者血液疾病息息相关[6-9]，但是其与淋巴瘤之间的关系尚未见报道,B细胞淋巴瘤作为一种高度异质性，高度恶性的肿瘤，目前在临床治疗上并无有效手段。

随着对肿瘤发生发展机制的研究不断深入，肿瘤靶向治疗开始成为现实和当前研究的热点。肿瘤靶向治疗，顾名思义，是专门针对肿瘤特异性靶点的治疗方法。一般来说，这些靶点所具有的共有特征是在肿瘤细胞中高表达，在正常细胞中低表达或不表达。通过阻止这些特异性的靶点，就可以抑制癌症的生长，杀死肿瘤细胞肿瘤。随着靶向治疗的研究的不断深入，不断寻找的新的肿瘤靶点或许会对治疗B细胞淋巴瘤提供新的思路。我们发现并确认了一种核糖体蛋白RPL34可以显著促进B细胞淋巴瘤的发生和生长，因而可以为淋巴瘤的靶向治疗提供一种新的可能，并且核糖体蛋白RPL34基于何种通路促进B细胞淋巴瘤的发生和生长也是值得更进一步探究的。