两面针茎段组织培养及防褐化技术研究

韦莹　余丽莹　黄雪彦　缪剑华　韦树根　董青松　秦双双　黄宝优

摘要：以两面针[Zanthoxylum nitidum （Roxb.）DC.]带芽嫩茎为外植体，研究了不同抗褐化剂对两面针组织培养中试管苗褐化的抑制效果。结果表明，在初代诱导培养基中添加1.0 g/L聚乙烯吡咯烷酮（PVP），外植体褐化程度轻，萌发率最高，为62.50%。3种添加抗褐化剂组合对试管苗抗褐化均起到一定抑制作用，添加PVP处理效果最理想，PVP浓度为1.0 g/L时，试管苗褐化率仅为11.67%，增殖系数为5.03，其次为活性炭（AC），抗坏血酸（维生素C）的抗褐化效果不明显。

关键词：两面针[Zanthoxylum nitidum （Roxb.）DC.];茎段;组织培养;试管苗;抗褐化

中图分类号：S853.75         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）22-0194-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.22.044           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on anti-browning and stem tissue culture of Zanthoxylum nitidum （Roxb.）DC.

WEI Ying，YU Li-ying，HUANG Xue-yan，MIAO Jian-hua，WEI Shu-gen，

DONG Qing-song，QIN Shuang-shuang，HUANG Bao-you

（Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants，Nanning 530023，China）

Abstract： Tender stems were used as explants， to discuss the effects of different anti-browning agents on the browning of plantlets in tissue culture of Zanthoxylum nitidum. The results showed that when adding 1.0 g/L PVP in first culture medium， the explants were light browning， The highest budding rate was 62.50%. Three combinations of adding anti-browning agent played a role in inhibiting browning on test tube plantlet，The best result was to add PVP. The browning rate was 11.67% in the presence of PVP was 1.0 g/L， the multiplication coefficient was 5.03，followed by AC，the anti browning effect of Vc was not obvious.

Key words： Zanthoxylum nitidum （Roxb.）DC.; stems; tissue culture; test tube plantlet; anti-browning

两面针[Zanthoxylum nitidum （Roxb.）DC.]系芸香科（Rutaceae）花椒属（Zanthoxylum）木质藤本植物，广泛分布于广东、广西、云南、贵州、四川、湖南、台湾、福建、浙江等省，生长于山野坡地灌木丛中，资源丰富、应用广泛[1]。两面针为中国南方地区的常用中药，具祛风活血、解毒消肿，散淤止痛之功能。常用于治疗胃痛、牙痛、神经痛、风湿骨痛、毒蛇咬伤等多种病症[2]，此外也应用于抗癌、洁齒，是三九胃泰、正骨水、跌打万花油等著名中成药和日用品两面针中药牙膏的主要原料[3]。

随着人们对两面针药材需求量日益升高[4]，加上生境破坏和不合理采挖，其野生资源濒临枯竭，因此市场上两面针药材的伪品也较多[5]，难以满足市场需求。两面针生药、成分、药理、临床等方面的研究，已取得一定进展[6]，关于组织培养方面的研究不多[7-9]，至今未有两面针试管苗抗褐化相关报道。植物组织培养具有繁殖速度快、繁殖率高的特点，但在两面针组织培养中，试管苗出现菌类污染、玻璃化、褐化等问题。褐化主要发生在茎段初代诱导及试管苗继代培养过程中，接触培养基部位、整个植株均出现不同程度褐化，严重影响了两面针试管苗的质量和繁育。本试验在前期组培研究基础上，进一步研究了维生素C、活性炭（AC）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP） 3种抗褐化剂对两面针褐化的抑制效果，旨在为工厂化生产优质种苗提供参考依据。

1  材料与方法

1.1  试验材料

2011年11月从广西龙州引种种植于广西药用植物园繁育圃，经广西壮族自治区药用植物园余丽莹研究员鉴定该品种为两面针，采摘无病虫害植株的幼嫩带芽茎段作为试验材料。

1.2  仪器与试剂

AIR TECH超净工作台，立式压力蒸汽灭菌锅，EL电子天平，电磁炉，pH酸度计，灭菌器等。

聚乙烯吡咯烷酮（PVP），活性炭（AC），抗坏血酸（维生素C），奈乙酸﹙NAA﹚，6-苄基腺嘌呤（6-BA）等。

1.3  方法

1.3.1  茎段灭菌与诱导  取两面针幼嫩带芽茎段，用洗洁精水溶液清洗表面污垢，流水冲洗5～8 min，再用75%乙醇溶液表面灭菌30 s，然后在0.1%氯化汞溶液中分别灭菌8、10、12 min，无菌水冲洗3～5次。

1.3.2  不同抗褐化剂对两面针外植体诱导的比较  用灭菌好的接种工具将嫩芽两端切掉，将长为1.2～1.5 cm的带芽茎段分别接种于不同培养基①MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA1.0 mg/L;②MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+维生素C 1.0 g/L;③MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+PVP 1.0 g/L;④MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+AC 1.2 g/L培养基上，观察并记录褐化、萌发情况，每瓶接种3个茎段。每个处理接种8瓶。

1.3.3  不同抗褐化剂对两面针试管苗生长的比较  将两面针试管苗剪切成1.2～1.5 cm的带芽茎段，接种到MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L及维生素C、PVP、AC不同浓度组合培养基中，其中抗褐化剂浓度分别为维生素C（0.2、0.5、1.0、1.5 g/L）、PVP（0.5、1.0、1.5、2.0 g/L）、AC（0.5、0.8、1.2、1.5 g/L），观察并记录褐化及萌发情况，每瓶接种6个茎段。每个处理接种10瓶。

1.4  统计方法

萌芽率=萌发芽数/接种外植体数×100%;褐化率=褐化外植体（苗）的块、株数/接种总数×100%。

1.5  培养条件

培养温度（25±2） ℃，光照度2 000 lx，光照时间12 h/d。

2  结果与分析

2.1  不同抗褐化剂对两面针外植体诱导的影响

以带芽茎段为外植体，接种于添加不同浓度抗褐化剂处理的MS诱导培养基中，比较不同抗褐化剂对外植体褐化及诱导情况的影响，结果如表1所示，处理1外植体接种5 d，切口开始出现轻微的褐色，培养7 d，接触培养基部位出现少量污染和褐化现象（图1），添加抗褐化剂的3个处理褐化情况差异较大，4个初代诱导处理中，以MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+PVP 1.0 g/L（处理3）生长调节剂组合对外植体抗褐化效果较为理想，褐化时间较晚，培养10 d出现轻微褐化，培养30 d，褐化率和萌发率分别为16.67%和62.50%，芽体嫩绿，长势好。

2.2  不同抗褐化剂对两面针试管苗生长及防褐化效果的影响

2.2.1  不同浓度维生素C对两面针試管苗褐化的影响  在组织培养过程中，维生素C具有防止组织变褐的作用。由表2可以看出，抗褐化剂维生素C对两面针试管苗有一定的防褐化作用，在浓度为1.0～1.5 g/L时效果比较理想，培养60 d后，褐化率最低为20.00%，苗增殖系数最高为3.58，株壮、叶绿，苗长势好，低浓度的维生素C对试管苗生长效果差，试管苗在培养15 d接触培养基部位开始出现褐化（图2），随后整个植株褐化，试管苗出现玻璃化、叶片枯黄和凋落的现象（图3）。

2.2.2  不同浓度PVP对两面针试管苗褐化的影响  PVP是一种水溶性物质，通过氢键与酚类物质结合，减少酚类物质的毒害，起到减轻褐化的作用。由表3可以看出，PVP对减少褐化情况有明显的效果，随着PVP浓度的升高，褐化得到控制，而且试管苗增殖系数均达到4.00以上，但是浓度过高，则会影响试管苗的增殖，甚至出现试管苗玻璃化的现象，4个不同浓度PVP均能在一定程度上起到抑制褐化的作用，当PVP浓度为0.5 g/L时，褐化率最高为21.67%;PVP浓度为1.0 g/L时抗褐化效果最佳，褐化率和增殖系数分别为11.67%和5.03。PVP抗褐化组合培养基培养的试管苗褐化发生时间较晚，25 d开始出现褐化，且褐化程度轻。

2.2.3  不同浓度AC对两面针试管苗褐化的影响  AC具有吸附特性，在试管苗继代增殖培养过程中，添加适当浓度活性炭对试管苗褐化起到一定抑制作用。由表4可见，活性炭浓度为0.5 g/L时褐化比较严重，且出现叶片枯黄凋落情况，褐化率最高，为25.00%;活性炭浓度为1.2 g/L时，褐化率和增殖系数分别为15.00%和4.53，株壮叶绿，随着浓度的进一步升高，试管苗褐化和增殖效果不理想。

3  结论与讨论

褐化是外植体由于自身分泌的酚类化合物的影响导致外植体褐变，是植物组织培养中一种常见的现象，直接影响到组织培养能否取得成功，褐化问题是植物组织培养中最常见的三大问题之一[10，11]。目前还未发现避免褐化的特效方法，科研人员根据不同植物采用不同试验手段，筛选出防止褐变的发生或者减轻褐变造成危害的最佳方法[12-15]。

两面针为木质藤本植物，进行初代诱导及试管苗增殖培养容易发生严重褐化。本试验探讨两面针组培过程抗褐化的方法，通过从茎段诱导、添加抗褐化剂等方面，总结两面针组培快繁过程中防褐化的相关技术，旨在促进两面针组培快繁技术的优化，为推广优质种苗提供技术参考。

采用连续转移初代诱导材料（试管苗）、暗培养方法进行抗褐化研究，发现效果不明显，随后通过在培养基中添加维生素C、PVP、AC进行防褐化试验。结果表明，3种抗褐化组合在一定程度上均能控制褐化，明显比不添加抗褐化剂的处理效果好。其中添加PVP浓度为1.0 g/L的处理褐化程度较轻，试管苗长势良好，增殖系数最高，而添加AC和维生素C的处理褐化圈较大，颜色较浓，试管苗长势及增殖效果稍差。

参考文献：

[1] 温尚开.两面针的研究概况[J].中草药，1995，26（4）：215-217.

[2] 余丽莹，黄宝优，谭小明，等.广西两面针野生种质资源调查研究[J].广西植物，2009，29（2）：231-235.

[3] 葛槐发，葛爱发.两面针在中医急症中的临床应用[J].时珍国药研究，1995，6（4）：6-7.

[4] 黄光伟.含两面针的漱口液[J].牙膏工业，2002（2）：32-34.

[5] 赖茂祥，饶伟源，严克俭，等.两面针茎及其伪品的生药鉴别[J].中药材，1994，17（3）：18-21.

[6] 刘绍华，覃青云，唐献兰，等.两面针的药学研究与开发利用[J].广西科学院学报，2005，21（2）：130-132.

[7] 汤丽云，何蔚思，何国振.两面针的愈伤组织诱导与分化[J].天然产物研究与开发，2017，29（8）：1290-1295.

[8] 韦大器，吴红英，何贵整，等.两面针的组织培养和快速繁殖[J].植物生理学通讯，2006，42（1）：73.

[9] 莫勇生，孙文波，张红岩.两面针的组织培养研究[J].农业研究与应用，2012（6）：16-20.

[10] 蒋益虹.百合褐变与多酚氧化酶和过氧化物酶活性关系的研究[J].浙江大学学报，2003，29（5）：518-522.

[11] 周俊辉，周家容，曾浩森，等.园艺植物组织培养中的褐化现象及抗褐化研究进展[J].园艺学报，2000，27（S）：481-486.

[12] 田如英，刘  燕，祁  翔，等.兔眼蓝莓外植体抗褐化技术初探[J].北方园艺，2009（12）：88-90.

[13] 张爱萍.活性炭在植物组织培养中的应用[J].中国果菜， 2009（2）：42.

[14] 梅兴国，董妍玲，潘学武.红豆杉细胞继代培养防褐变措施的研究[J].天然产物研究与开发，2001，13（4）：8-11.

[15] 刘均利，马明东.华盖木组织培养中褐化控制研究[J].浙江林业科技，2007，27（1）：20-23.