一种茶枝致病菌的分离鉴定及致病力分析

张兰，郭华伟，李梦菡,2，廖杨文科，李鑫*，韩文炎*

一种茶枝致病菌的分离鉴定及致病力分析

张兰1，郭华伟1，李梦菡1,2，廖杨文科3，李鑫1*，韩文炎1*

1. 中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008；2. 中国农业科学院研究生院，北京 100081；3. 南京林业大学生物与环境学院南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037

采用形态学和分子鉴定方法确定采自建德市大同镇茶园茶枝的致病菌为镰刀菌与茶炭疽菌，鉴定并报道为茶树致病菌。龙井43和中茶108离体叶片及茎秆用于两种病原菌致病力分析试验，结果显示，对龙井43嫩叶及茎秆具有较强侵染力，是造成该茶枝茎秆病害的主要致病菌，并且可能与.共同侵染茶树叶片。因此，在今后茶树病害识别与防控方面需要密切关注。

形态学鉴定；分子鉴定；茶枝；镰刀菌；致病力

茶树是我国重要的经济作物，多生长在温暖多雨的暖温带、亚热带地区。气候温热多雨导致茶区病害大量滋生且种类繁多[1]。真菌病害是茶树病害中数量最多的一类。据统计，我国已记载的138种茶树病害中，真菌病害就有72种[2]，多危害茶树芽、叶、茎及根部，如茶饼病、茶炭疽病、茶云纹叶枯病、茶枝梢黑点病和茶红根腐病等，严重影响茶树生长、茶叶品质和产量[3]。

因茶树病原真菌种类多，且部分有性、无性阶段分类混乱，同时还存在近似种内生菌的干扰，导致了茶树病原菌鉴定的复杂性[4]。基于DNA序列的分子分类技术克服了传统形态学鉴定方法繁杂且难以确定真菌合适分类地位的缺陷，成为目前植物真菌病原鉴定的新趋势。其中，真核生物核糖体DNA（Ribosome DNA，rDNA）的转录间隔区序列（Internal transcribed spacer，ITS）作为分子标记最先应用于植物病原真菌的分类、鉴定和病害诊断[5-6]。随后，多种基因如β-微管蛋白基因（Beta-tublin，β-Tub）、肌动蛋白基因（Actin，ACT）、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、钙调蛋白基因（Calmodulin，CAL）等也被应用于病原真菌的鉴定和分类研究，多基因序列的系统进化分析克服了单基因序列鉴定的不准确性，应用也更加广泛。

本试验利用传统形态学分类结合分子分类技术，鉴定了一种采自建德市大同镇茶园枝条的致病菌并分析其致病力，为后期茶园病害防治提供理论和指导依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

茶枝采自建德市大同镇茶园的乌牛早品种，该病害在此茶园普遍发生。2018年8月15日在茶园均匀取样进行病原菌分离鉴定。用于病原菌致病力分析的龙井43和中茶108叶片及枝条采自杭州龙冠实业有限公司茶园。

1.2 试验方法

将茶枝叶腋及叶片的病健分界处切成小块，无菌消毒后置于灭好菌的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基中，封口膜封口，于26℃生化培养箱中培养至产生菌丝。用无菌刀在菌落边缘切下约1 cm×1 cm的菌丝块，置于新PDA培养基中，26℃继续培养至菌丝产生。按上述方法纯化3~4次。

取纯化3~4次后的病原菌约0.5 cm×0.5 cm菌丝块，接种至划伤的龙井43叶片上，接种后的叶片置于铺有浸水纱布的托盘中，托盘用保鲜膜封口，于26℃生化培养箱中培养至病斑扩展，采用上述方法再次分离纯化得到病原菌。

1.2.2 病原菌形态学及生长速度观察

取约0.5 cm×0.5 cm病原菌菌丝块至PDA培养基中，设置5个重复，26℃恒温培养7 d，十字交叉法测量并记录每天的菌落直径。观察并记录菌落在PDA培养基上的颜色、质地及菌丝特征，使用蔡康XSP-13CC显微镜观察菌丝及分生孢子形态，拍照并测量孢子大小。

1.2.3 病原菌PCR鉴定

菌丝布满培养基后，用无菌刀刮至1.5 mL无菌离心管中，液氮速冻。采用植物组织DNA提取试剂盒（TIANGEN）提取病原菌DNA，然后进行PCR扩增。试验采用ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；BT2a：5'-GGTAACCAAATCGGTCCTGCTTTC-3'，BT2b：5'-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'；ACTF：5'-ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC-3'，ACTR：5'-TACGAGTCCTTCTGGCCCAT-3'引物分别扩增病原菌DNA的ITS、β-Tub与ACT基因序列[7-8]。50 μL PCR反应体系包括：Premix Taq（TAKARA） 25 μL，浓度稀释为10 μmol·L-1的正、反向引物各2 μL，无菌ddH2O 19 μL，DNA模板2 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，40个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。取5 μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定条带，大小符合要求的样品送杭州尚亚赛生物技术有限公司纯化测序。

1.2.4 多基因进化树的构建

3.1 传统的数字PCR是进行绝对核酸量化的方法，它基于在有限稀释的条件下将各个分析物分子分配成许多重复反应的绝对核酸定量方法，在大多数反应中产生1个或0个分子。终点PCR后，模板的起始浓度通过泊松分布统计分析确定阳性（含有扩增的靶标）和阴性（未扩增的靶标检测的反应）。数字 PCR比qPCR具有许多潜在的优势。近来，该技术已经商业化，将反应分为纳米级大小的液滴。数千个液滴的快速微流体分析每个样品使ddPCR适用于常规使用，并大大提高了系统的实际动态范围（对每个液滴的多个目标分子进行泊松校正）[20]。

将测序得到的ITS、β-Tub与ACT基因序列分别在NCBI中进行BLAST，根据比对结果，参考文献[7,9]，从GenBank数据库中下载同源性较高的序列或已知菌种序列，与试验真菌的测序序列一起，利用MEGA 7.0中Maximum Likelihood方法分别构建基因进化树。

1.2.5 病原菌离体接种

分别取龙井43与中茶108芽下三叶、五叶各15片作为嫩叶和成熟叶接种病原菌。在叶脉一侧叶片表皮上轻划3道2 mm的平行伤口作为1个接种点（以叶脉对称，嫩叶划2个接种点，成熟叶划4个接种点）。将菌丝均匀的菌落划成2 mm×2 mm的菌落块，置于接种点上；混合接种则将两病原菌各1 mm×2 mm的菌落块水平放置于同一接种点上。两品种嫩叶、成熟叶各5片为对照组，接种点上放置同等大小PDA培养基块。接种好的叶片放于铺有浸水纱布的托盘内保湿，托盘用保鲜膜封闭后放于26℃生化培养箱中。接种4 d后叶片产生扩展性病斑，相机拍照，用十字交叉法测量病斑直径并统计发病率（后期接种点处形成圆形病斑即为发病，各处理发病率=总发病接种点数/总接种点数）。

剪长度为30 cm的龙井43和中茶108茶枝，在芽下第四叶叶柄处的茎秆上用无菌刀划5道平行茎秆的0.5 cm伤口作为接种点，接种1 cm×0.5 cm菌丝块；混合接种则是将两病原菌各0.5 cm×0.5 cm的菌落块平行置于同一接种点上。每个处理10个重复。对照组在接种点放置同等大小的PDA培养基块。接种点接种后缠上无菌纱布，将枝条插入蒸馏水中，室温放置，纱布每天喷施蒸馏水保持湿度。待接种12 d后茎秆发病，相机拍照。

1.2.6 数据分析

采用Excel 2010进行数据整理，SAS 8.1统计软件进行显著性差异分析，MEGA 7.0软件构建系统进化树，Photoshop CS3进行图像处理，OriginPro 8.0作图。

2 结果与分析

2.1 茶枝发病特点观察

由图1所示，茶枝从叶柄处的茎秆上发病，病斑多呈灰黑色不规则水浸状。病斑从叶柄处继续向叶片扩展，并沿叶脉向叶尖和叶边缘侵染，叶背面病健交界处呈现深绿色水渍状。叶片病斑初期为褐色，后变灰白，其上着生许多灰黑色小粒点。后期病斑进一步扩大，致使叶片干枯坏死或脱落。嫩叶叶柄失水变黑，叶片萎蔫、卷曲下垂。

2.2 病原菌分离与形态学鉴定

采用组织分离法得到分离率为43.8%和37.5%的纯培养性状显著不同的两种病原真菌。将两种病原菌2 mm×2 mm的菌丝块接种至划伤的龙井43叶片上，产生病斑后按组织分离法再分离纯化，得到的病原菌与接种病原菌的培养性状相同，分别命名ZJX与ZJY（图2）。

ZJX在PDA培养基上26℃恒温培养的生长速度为0.77 cm·d-1（图2-A）。菌落白色，生长旺盛，后期夹带淡黄色，背面产生黄色或淡黄褐色色素；气生菌丝繁茂，羊绒状，白色至淡黄色，菌丝有横隔，分枝；大型分生孢子长纺锤形或镰刀状，3~5个隔，约(22.0~36.8)μm ×(3.2~5.2)μm；小型分生孢子形态多样，长椭圆形、肾形或披针形，0~3个隔，约(8.8~16.3)μm ×(2.0~3.6)μm；未见厚垣孢子（图2-B）。根据形态特征，对比文献[10-13]，初步判定ZJX为镰刀菌。

ZJY在PDA培养基上26℃恒温培养的生长速度为1.17 cm·d-1（图2-A）。菌落边缘规则，气生菌丝白色、短而致密、绒毛状，部分菌丝有隔；ZJY产生大量的橙红色分生孢子堆及黑色的分生孢子座，从菌落中心开始向外扩展生出；分生孢子透明，两端钝圆，长椭圆形，大多中间缢缩，大小约(13.2~15.9)μm×(4.0~5.8)μm（图2-C）。由上述特征初步判定ZJY为炭疽菌属，但无法确定种。

图1 茶园采回的病害枝条及叶片

图2 病原菌分离与形态学特征

2.3 病原菌分子鉴定

对两种病原菌DNA的ITS、β-Tub和ACT基因克隆后测序，分别得到519、552 bp的ITS序列，314、463 bp的β-Tub序列和251、256 bp的ACT序列。

将ZJX的ITS、β-Tub及ACT序列分别比对，从结果中下载同源性较高的序列信息，构建进化树。ITS序列比对结果显示，ZJX与（MG808373.1）聚在同一支，支持率94%，亲缘关系最近（图3-A）。β-Tub序列比对结果证实，ZJX与（KJ020861.1）聚在一个较大的分支上，两者亲缘关系最近（图3-B）。ACT序列比对结果则表明ZJX与（JQ342171.2）亲缘关系最近（图3-C）。结合ZJX的形态学鉴定结果，确定其为镰刀菌。

ZJY的3个基因序列比对后均显示其为茶炭疽菌。根据王玉春[9]的研究结果，从Genbank中下载了我国主要产茶区分离并鉴定得到的11个茶炭疽菌种的ITS、β-Tub及ACT基因序列信息，分别构建进化树（图3-D—3-F）。结果表明，ZJY与聚在同一分支，支持率分别为85%、92%、89%。因此，判定ZJY为茶炭疽菌。

图3 基于ZJX与ZJY DNA的ITS、β-Tub和ACT序列分析构建进化树

2.4 病原菌致病力比较与分析

采用龙井43、中茶108离体叶片与茎秆单独或混合接种两病原菌，进一步比较与分析其致病力。结果表明，比对龙井43和中茶108叶片的致病力弱。在龙井43嫩叶上形成的病斑面积小于（图4-A和4-C）；且在龙井43成熟叶、中茶108嫩叶及成熟叶上未形成明显病斑（图4-A），发病率分别只有16.7%、15%、4.2%，显著低于在龙井43成熟叶、中茶108嫩叶及成熟叶的发病率86.3%、82.5%、25%（图4-B）。但对龙井43嫩叶有较强致病力，导致混合接种的发病率及病斑面积与单独接种没有显著差异（图4-A—C）茎秆接种结果显示，两病原菌对龙井43的致病力明显强于中茶108。在龙井43茎秆上产生大面积黑褐色病斑并向叶柄及叶脉处延伸，在龙井43茎秆上未形成扩展性病斑。病原菌混合接种的发病程度轻于单独接种，重于单独接种（图4-D）。

注：图中“+”表示接种相应菌种，“-”表示未接种；图4-C中不同的字母表示存在显著性差异（P＜0.05）

3 讨论

本试验对采自建德市大同镇茶园茶枝的病原菌进行分离鉴定，利用形态学与分子鉴定方法确定茶枝致病菌为镰刀菌.及茶炭疽菌，并进行了两种病原菌致病力分析。

镰刀菌是侵染植物维管束系统的重要致病菌，寄主广泛且危害严重[14-18]。镰刀菌亦是茶树致病菌，多造成茶树茎腐和根腐性病害[19-22]，彭成彬等[7]则首次鉴定并报道三线镰刀菌为金萱茶叶片致病菌。镰刀菌.可造成甜瓜果腐、玉米茎腐、竹秆溃烂、木蜡果斑[[10-13]等多种病害，而.系乌牛早茶树的致病菌在本研究中被首次鉴定并报道。

茶炭疽菌是茶树重要病原菌，我国茶炭疽菌分类鉴定及系统发育学分析已取得丰富的成果[9,23-24]。炭疽菌菌落颜色、生长速度、气生菌丝及分生孢子大小等纯培养特征在其分类鉴定上具有重要的参考价值[25]。在本研究中，ZJY DNA中ITS、β-Tub和ACT基因序列的进化分析结果显示其为茶树已知炭疽菌（图3-D—3-F），支持率分别为85%、92%、89%，但ZJY纯培养特征与已报道的特征存在差异[9,24]（图2），这可能与菌变异、地理隔离或培养环境有着密切关系。

刘威等[26]首次发现为茶炭疽病菌的新种，其与同为我国茶树优势致病种[9]。本试验结果也证实对龙井43叶片具有强致病力。而与相比，.对茶树茎秆的致病力更强，但其也易侵害龙井43嫩叶（图4）。试验茶枝病斑从叶柄基部茎秆开始，沿叶柄与叶脉向叶边缘扩展（图1），病症显著不同于常见茶炭疽病叶表型[3,24]。结合镰刀菌易侵染植物维管束系统的现象可推测，.可能是先侵染该茶病枝的茎秆，当侵染至叶脉处后，又与共同侵染。另外，与龙井43相比，中茶108防御[9]与.侵染的抗性更强（图4），推测中茶108可能对真菌病害具有广谱抗性。

综上，本研究首次鉴定并证实镰刀菌（.）是一种茶树致病菌，其对龙井43嫩叶、茎秆具有较强致病力，为今后茶树真菌病害防治提供了理论基础。

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Identification and Pathogenicity Analysis of Pathogens in Tea Branches

ZHANG Lan1, GUO Huawei1, LI Menghan1,2, LIAO-YANG Wenke3,LI Xin1*, HAN Wenyan1*

1. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Science, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3. Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, College of Biology and the Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China

The pathogens of diseased tea branches in tea garden of Datong town, Jiande city were identified by morphological and molecular methods. Two fungal pathogens were identified, namelyand.here was reportedas the pathogen of tea trees. Leaves and stems of Longjing43 and Zhongcha108 were used in the experiment to analyze the pathogenicity of the two pathogens. The results show thathad strong pathogenicityto young leaves and stems of Longjing43, indicating it is the main pathogen causing relative disease.andmight infect tea leaves together which needs more attention in tea disease recognition, control and prevention in future.

morphological identification, molecular identification, tea branch,,pathogenicity

S571.1；S435.711

A

1000-369X(2019)06-661-08

2019-06-11

2019-07-07

国家重点研发计划政府间国际科技创新合作重点专项（2017YFE0107500）、浙江省自然科学基金（LY19C160009）、中国农业科学院科技创新工程、国家自然科学基金（31600482）

张兰，女，硕士，助理研究员，主要从事茶栽培与生理生化研究，zhanglan@tricaas.com。