大分子拥挤环境对不同糖基化MUC5AC折叠和聚集的影响①

景 雯 童 瑾

(重庆医科大学附属第二医院呼吸与危重症医学科,重庆 400010)

慢性气道炎症黏液高分泌时，杯状细胞内呈现异常拥挤状态，而这种大分子拥挤环境有利于糖基附着于蛋白质上从而提高蛋白的糖基化程度[1]。研究发现，细胞内的大分子拥挤环境会使介质的黏度增加从而减少小分子物质和蛋白质的扩散速率[2，3]。因此我们推测气道杯状细胞内大分子拥挤推动高度糖基化MUC5AC的折叠和异常聚集从而发生分子构象、组态的改变。目前关于体外模拟大分子拥挤环境，研究其对蛋白质折叠和聚集影响作用的报道有很多，但尚未有关于MUC5AC糖基化在大分子拥挤环境中折叠和聚集效应的研究，本实验首次在大分子拥挤环境中研究了气道MUC5AC折叠和聚集过程，进而验证了大分子拥挤影响糖基化MUC5AC的错误折叠并加速其聚集。

1 材料与方法

1.1材料 pATX2表达载体、HEK-293细胞株、HEK-TF无血清培养基、Lipo2000转染试剂盒、胶回收试剂盒和糖苷酶PNGase F购自成都贝思迪生物有限公司；Ni-NTA 纯化试剂盒购自Qiagen;盐酸胍(GdnHCl)购自重庆衍庆生物；考马斯亮蓝 G-250、大分子拥挤试剂(BSA、Ficoll70、Dextran70、 PEG2000)和 Tris-HCl缓冲液均购自Sigma公司；PAS染色试剂盒(重庆葆光生物技术有限公司)；其他试剂均为国产分析纯。实验中用于蛋白质去折叠相关试剂配制的缓冲液均为10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)。

1.2方法

1.2.1重组黏蛋白MUC5AC的表达和纯化 首先利用PCR技术选择性扩增了含有两个糖基化位点的基因片段Mucin-5AC[5500-5654]，得到的MUC5AC cDNA片段经EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切后，再克隆入真核表达载体pATX2的两酶切位点EcoR Ⅰ和Not Ⅰ之间，在c-末端加上His标签，形成重组表达载体 MUC5AC-pATX2，并转染至HEK293细胞内，在无血清培养基中培养并诱导目的蛋白表达。表达产物用镍离子亲和层析柱进行纯化，紫外分光光度计检测蛋白浓度，并经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色确定蛋白纯度和分子量大小[4,5]。

1.2.2去糖基化MUC5AC的制备 已知哺乳系统表达的MUC5AC具有两个N-糖基化位点。因此可用PNGase F糖苷酶切除糖基[6]。每1 mg MUC5AC蛋白样品中加入100 U(1 U/μl)的PNGase F，37℃水浴条件下酶切12 h，不加PNGase F的天然MUC5AC作为对照。分别将实验组和对照组蛋白进行SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色分析分子量变化情况，并进行糖原染色(PAS染色)验证去糖基化结果。

1.2.3天然MUC5AC(n-MUC5AC)、去糖基MUC5AC(d-MUC5AC)的变性和复性 Li等[7]在研究大分子拥挤环境对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6pDH)和蛋白质二硫异构酶复性的影响时，使用了Ficoll70、Dextran70、PEG2000、BSA、卵清白蛋白和溶菌酶作为不同拥挤试剂，浓度梯度为0 g/L、50 g/L、100 g/L、150 g/L和200 g/L。因此本实验利用BSA、Ficoll70、Dextran70和PEG2000作为拥挤试剂体外模拟四种不同的大分子拥挤环境。分别取15 μl n-MUC5AC和 d-MUC5AC溶液各自加入30 μl 6 mol/L盐酸胍溶液，于室温下变性1 h。将15 μl以上完全变性的蛋白溶液与585 μl 分别含有BSA、Ficoll70、Dextran70和PEG2000的Tris-HCl缓冲液混合进行复性处理，设置大分子拥挤试剂的终质量浓度梯度ρ为50 g/L、100 g/L、200 g/L，用不含拥挤试剂的10 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)作为对照组[8]。

1.2.4复性动力学分析 蛋白质的聚集采用浊度法则量，即25℃室温条件下用紫外分光光度计连续监测复性过程中蛋白质在488 nm处吸光度的变化。每个时间点数据取3次实验的平均值并绘制复性动力学曲线。

2 结果

2.1重组MUC5AC在HEK-293细胞中的表达纯化 SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色结果显示获得较纯净的目的蛋白(图1),蛋白纯度>90%,分子量约为40 kD。

图1 重组MUC5AC在HEK293中的表达纯化Fig.1 Expression and purification of recombinant MUC5AC in HEK293Note:A.Purification of the MUC5AC in HEK293 cell culture;IN.Supernatant;FT.The flow-through of the Ni-NTA column;W.The washing(PBS,pH7.5);E1-E11.The elution;M.Protein molecular weight marker；B.Purified human recombinant MUC5AC.Lane 1.The final protein sample.

2.2去糖基化结果分析 n-MUC5AC经PNGase F糖苷酶去糖基化后经SDS-PAGE检测电泳条带迁移情况如图2所示。n-MUC5AC经酶切后，分子量由40 kD下移至17 kD左右。PAS染色后仅n-MUC5AC在40 kD处显色，酶切后的蛋白未见显色，说明n-MUC5AC经PNGase F糖苷酶消化后糖基基团已完全去掉。

图2 染色分析MUC5AC去糖基化结果Fig.2 Staining analysis of MUC5AC glycosylation resultsNote:A.Coomassie brilliant blue staining;B.PAS staining.M.Protein molecular weight marker;L1.n-MUC5AC;L2.d-MUC5AC.

2.3大分子拥挤试剂对不同糖基化程度MUC5AC复性产率的影响 将15 μl完全变性的两种蛋白溶液分别加入585 μl ρ为50 g/L、100 g/L、200 g/L的BSA、Ficoll70、Dextran70、 PEG2000的溶液中复性，用紫外分光光度计测定其在488 nm处光吸收度的变化，并与蛋白在对照缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl、pH8.0)中的复性结果做比较，蛋白的复性产率以复性结束后各蛋白吸光度值占天然MUC5AC吸光度值百分比表示，结果见图3～5。变性的n-MUC5AC在稀溶液体系中的复性产率大约为变性前的75%(d-MUC5AC为80%)，而在ρ=200 g/L 的4种大分子拥挤试剂中，两种变性的蛋白几乎不能复性，复性产率仅为5%～10%；当ρ为50和100 g/L时，变性n-MUC5AC的复性产率可达50%～60%，变性d-MUC5AC的复性产率可达60%～70%。另外，由图5可看出，在稀溶液体系中，变性的d-MUC5AC复性情况与n-MUC5AC相比无统计学意义(P>0.05)，但在4种大分子拥挤试剂中，其复性产率均高于n-MUC5AC(P<0.05)。综上，当大分子拥挤试剂的质量浓度ρ选在50或100 g/L时两种蛋白质均能很好的复性，由于生物体内的大分子浓度高达80～400 g/L[9-11]，因此后续实验选用ρ=100 g/L作为最适质量浓度。

图3 不同质量浓度的大分子拥挤试剂对n-MUC5AC复性产率的影响Fig.3 Effects of different mass concentrations of macromolecular crowding reagents on refolding yield of n-MUC5ACNote:*.P<0.05,**.P<0.01,vs 0 g/L macromolecular crowding reagents group(control group).

图4 不同质量浓度的大分子拥挤试剂对d-MUC5AC复性产率的影响Fig.4 Effects of different mass concentrations of macromolecular crowding reagents on refolding yield of d-MUC5ACNote:*.P<0.05,**.P<0.01,vs 0 g/L macromolecular crowding reagents group(control group).

图5 两种蛋白在稀溶液及相同浓度大分子拥挤环境中复性产率的比较Fig.5 Comparison of refolding yield of two proteins in dilute solution and macromolecular crowded environment with same concentrationNote:*.P<0.05,vs n-MUC5AC group(control group).

2.4两种蛋白在不同拥挤环境中复性过程随时间变化情况 两种蛋白在稀溶液中复性产率随时间变化情况相似，都经历了快-慢两个阶段：在前60 min内蛋白复性产率可以恢复到天然蛋白的60%左右，60 min以后复性速率明显减慢，90 min以后基本保持不变；而在4种拥挤试剂中的复性过程都转变为了慢-快-慢三个阶段：前30 min内，蛋白复性速率最缓慢，在30～150 min内蛋白复性速率最快，150 min以后复性速率基本维持不变。统计结果显示，4种拥挤试剂中两种蛋白的复性速率与稀溶液相比明显减慢,复性产率也降低,差异有统计学意义(P<0.01)。见图6。

图6 两种蛋白在对照缓冲液及拥挤环境中复性的时间变化曲线Fig.6 Curve of refolding time of two proteins in control buffer and crowded environmentNote:A.n-MUC5AC;B.d-MUC5AC;**.P<0.01,vs d-MUC5AC(control group).

2.5大分子拥挤对不同糖基化程度MUC5AC复性过程中聚集的影响 变性的MUC5AC在不同复性体系中聚集程度监测结果如图7，当大分子拥挤试剂的浓度一定(ρ=100 g/L)时，两种蛋白在4种拥挤试剂中的聚集程度与缓冲液对照组相比显著增高,差异具有统计学意义(P<0.01),含PEG2000的复性溶液中蛋白质聚集程度最高，BSA中蛋白聚集程度次之，Ficoll70和Dextran70中蛋白聚集程度相当，缓冲液对照组中的蛋白聚集程度最低。另外，在四种不同大分子拥挤试剂中，n-MUC5AC的聚集程度均比d-MUC5AC高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图7 大分子拥挤试剂对MUC5AC复性过程中聚集的影响Fig.7 Effects of macromolecular crowding reagents on aggregation during refolding of MUC5ACNote:**.P<0.01,vs dilute solution(control group)；#.P<0.05,vs n-MUC5AC(control group).

3 讨论

MUC5AC是气道黏液的主要成分[12]，主要由气道杯状细胞分泌，是高度糖基化的大分子蛋白质[13]。其分泌数量增加及糖基化程度升高，与异常拥挤的细胞内环境——大分子拥挤环境有关[14]。本实验通过制备去糖基化的MUC5AC，对比分析了大分子拥挤环境对不同糖基化程度MUC5AC折叠和聚集的影响。本研究显示，在相同浓度的同一大分子拥挤试剂中，n-MUC5AC的复性产率明显低于d-MUC5AC的复性产率；复性过程中的聚集程度也高于后者，说明糖基化水平增高一定程度上促进了蛋白的聚集。有研究证实，过度糖基化MUC5AC的Thr2位糖链上甲基易与侧链的脯氨酸残基形成疏水键连接[14，15]，促使整个分子构象呈现更加伸展的链状结构。这种链状结构因有利于肽链的进一步糖基化修饰，而成为糖基化修饰的优势构象，但这却使得MUC5AC因过多的疏水键和松散结构，在大分子拥挤环境中折叠更容易形成聚集。这种异常聚集又将加剧原有的细胞内大分子拥挤，最终形成恶性循环。

质量浓度ρ=200 g/L的大分子拥挤试剂严重抑制了蛋白质的复性过程，而ρ=100 g/L时复性产率明显升高，这不仅仅是质量浓度降低的结果。通常大分子拥挤试剂对蛋白质复性的影响是双重作用，一方面拥挤效应促使新生肽链从松散构象向天然蛋白的紧密构象转变，增加蛋白质的折叠机会，另一方面也增强了蛋白质的聚集趋势引起部分折叠蛋白质之间的相互聚集，从而降低了部分折叠蛋白转变成为天然功能蛋白的数量。而蛋白质的折叠和错误聚集之间是竞争的关系，前者可提高蛋白质的复性产率，后者则具有相反的作用[16]。高浓度拥挤试剂存在的情况下推动蛋白质错误聚集的作用占据了优势，导致蛋白质的复性产率接近于零，而低浓度的拥挤试剂存在时可同时产生两种作用，正作用的效果抵消了副作用的大部分效果，导致蛋白质的复性产率提高。

不同拥挤试剂对蛋白复性过程中折叠和聚集的影响可能与各拥挤试剂本身的分子结构及其与蛋白之间的空间排斥作用有关。PEG2000的结构类似球形颗粒，更倾向于使蛋白形成沉淀，但不能帮助其正确折叠，因此尽管在这4种拥挤试剂中PEG2000的相对大小是最小的，但PEG2000比其余3种拥挤试剂有着更强的体积排斥效应[17]。我们的实验结果表明，无论是n-MUC5AC还是d-MUC5AC，在PEG2000中的复性产率都是最低的。BSA和Ficoll70为球状分子，而Dextran70为无交联结构或具有部分交联结构的棒状分子，MUC5AC在BSA和Ficoll70中复性的动力学过程与Dextran70相比，具有相似的动力学曲线，但二聚化的速率更慢，说明棒状的Dextran70与球状的BSA和Ficoll70相比具有更强的稳定性[10,18]。

蛋白质折叠是分子生物学中心法则中至今尚未解决的一个重大问题，蛋白质折叠发生故障形成错误的空间结构，不但将丧失其生物学功能，甚至会引起相关疾病，即蛋白质构象疾病。其中，阿尔兹海默症、帕金森症、亨廷顿氏舞蹈症等神经退行性疾病和癌症在内的各种各样的疾病都与蛋白质的错误折叠和聚集紧密相关[19,20]。MUC5AC不仅与支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病和肺纤维化等肺部疾病密切相关[21]，同时也与黏液性结直肠腺癌、胰腺癌以及某些眼表疾病的发病有关[21-24]。因此对MUC5AC折叠和聚集的研究，一方面可以从分子层面深入认识疾病发生发展的具体机制，探索更明确、更先进的诊断方法；另一方面通过认识导致蛋白质错误折叠的原因和途径，发展防止蛋白质错误折叠的方法，以MUC5AC作为治疗靶点探索新的治疗策略。有研究发现细胞内存在某些辅助折叠分子如分子伴侣以及天然酚类化合物可避免蛋白质异常聚集[25,26]，以保证多肽链在大分子拥挤环境中的正确折叠。我们今后的工作将继续探究分子伴侣在大分子拥挤环境影响MUC5AC折叠、聚集过程中的补偿效应，为慢性气道炎症性疾病的有效防治提供新理论和药物新靶点。