刺梨中芦丁的提取及其抑菌效果的研究

杨阳，李祥松，郭倩

（1.大同大学生物科学学院，山西大同 037009；2.北京索莱宝科技有限公司，北京 101102）

刺梨是我国贵州省等地的特产蔷薇科植物，其果实成熟后散发出浓烈的香味，外形多数为椭圆球状，表面长有很多类似仙人掌外壳的小刺，故被称为“刺梨”[1]。刺梨富含多维生素P（芦丁）和SOD（超氧化物歧化酶），含量远超其它水果，是世界上已知水果中含量最高的品种[2]。芦丁又称芸香苷、维生素P，属于维生素类药，有研究证明芦丁是提高心脑血管疾病治疗效果的关键[3]。

本实验通过碱提取、酸沉淀法提取刺梨中的芦丁，有效测定其芦丁含量，并选用3种菌进行抑菌实验，为刺梨的应用、芦丁新资源的开发以及抗菌药物的研发提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料：刺梨干果（产地：贵州），芦丁对照品（江西佰草源生物科技有限公司），饱和石灰水、浓盐酸12 mol/L、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠（分析纯）、乙醇（分析纯）、甲醇（色谱纯）均来自鑫顺源科贸有限公司。水（重蒸水）、琼脂、蛋白胨、牛肉膏、氯化钠均来自北京索莱宝科技有限公司。大肠埃希氏菌（ATCC8739）（青岛绿谷有限公司）、金黄色葡萄球菌（CMCC26003）（招远拓普生物工程有限公司）、枯草芽孢杆菌（CMCC63501）（招远拓普生物工程有限公司）。

仪器：UV725紫外-可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司），100SD超声波清洗器（深圳市超洁科技实业有限公司），SHB-IIIA循环水式多用真空泵（长沙明杰仪器有限公司），TopPette移液枪(济南来宝医疗器械有限公司)，DH-600AS电热恒温培养箱（北京市恒诺利兴科技公司），JM-B电子天平（余姚市纪铭称重校验设备有限公司），YXQ-30SII高压灭菌锅（上海博讯医疗生物仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 芦丁的提取与精制

实验采用碱提取、酸沉淀法提取与精制芦丁。称取刺梨3g，在乳钵中研磨至粉末状，放于100 mL烧杯中，加入30 mL饱和石灰水（以棉花过滤至澄清），调节pH至7～8，期间不断搅拌，加热煮沸15 min，趁热以棉花过滤（过滤前应将棉花用水充分润湿，赶出其中的气泡）。向残余物中添加饱和石灰水至pH为7～8，在煮沸条件下搅拌10 min，趁热过滤，防止Ca(OH)2析出使液体变浑浊。将两次得到的滤液混合、放冷。向冷却后的滤液中缓慢添加浓盐酸，并用玻璃棒搅拌，调节pH至3～4，放置24h以上后倒出上清液，将剩下的溶液残渣抽滤，并用蒸馏水将其pH洗至5～6。此法操作简单，适合工业大量生产，但实验过程中要控制好pH，防止因提取过程中芦丁溶解不足或再次溶解，影响芦丁的提取率[4]。

对粗提取物进行二次提取，加入30 mL的重蒸水进行加热，加入饱和石灰水使得pH调节至8～9，使芦丁充分溶解，趁热过滤，防止Ca(OH)2析出使液体变浑浊。使滤液自然冷却，向滤液中加盐酸调节pH至4～5后静置，抽滤沉淀，再用蒸馏水将其pH洗至5～6。

1.2.2 芦丁含量测定

1.2.2.1 对照品溶液的制备

称取芦丁对照品20 mg，用60%的乙醇溶液超声处理使其溶解，配制成浓度为0.2 mg/mL的标准贮备液。

1.2.2.2 标准液的制备

如表1所示，配置5个浓度标准溶液和1个空白溶液。添加试剂后，用30%乙醇溶液定容至25 mL，混合均匀，静置6 min，用紫外分光光度计在510nm处测定吸光度值。

表1 不同浓度标准品的制备

1.2.2.3 样品测定

移液管量取浓度为0.2 mg/mL（标示浓度）的芦丁提取液5.0mL，按照标准曲线的制备方法同样置于25 mL容量瓶中，依次添加试剂，最后在510 nm波长下测定吸光度值。芦丁含量的计算方法为：

1.2.2.4 样品稳定性实验

将芦丁待测液每间隔1 h测量一次吸光度值并记录，共测量5次。期间要注意常温保存，并避免阳光直接照射

1.2.3 抑菌实验(纸片扩散法)

1.2.3.1 抑菌药液的制备

用无菌水将芦丁提取物分别配制成5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL和40 mg/mL的溶液，放置备用。

1.2.3.2 接种和纸片贴放

准备好固体培养基，分别称取胰蛋白10g、酵母提取物5g和NaCl 10g,置于烧杯中；加入800ml蒸馏水于烧杯中，用玻璃棒搅拌，使药品全部溶化；用1MNaOH调PH至7.2；将溶液倒入量筒中，加入15 g琼脂粉，补加蒸馏水1L；高压蒸汽灭菌20 min；待培养基温度降至50℃时，在超净台上加入所需抗生素，摇匀；铺板，90 mm直径的培养皿约需20 ml培养基；待培养凝固（约10分钟后），将平板倒置，4 ℃保存，使用移液枪吸取各配置好的菌悬液0.05 ml分别加入培养基，进行平板涂布后，静置待表面干燥后待用，一定要注意对涂布器进行酒精灯灭菌，避免菌种之间感染。

用打孔器准备直径为8 mm的滤纸片，每个接种过的平板贴放5个同等大小的纸片。将纸片放入不同质量浓度（5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L）的药液中，使其完全浸湿，之后贴放于平板表面，做好记号，纸片与纸片、纸片与平板边缘之间要保持20 mm以上的距离，避免影响测量结果，以无菌水浸湿的纸片为阴性对照。放好后，用镊子轻按纸片表面，于37 ℃恒温培养箱培养24 h，观察抑菌圈的大小。实验重复3次取平均值得出抑菌圈大小，通过比较得出不同质量浓度的芦丁药液对3种菌的抑菌效果。

1.3 数据分析

利用Excel 2003进行标准曲线的绘制与数据分析。

2 实验结果

2.1 芦丁的提取与精制

3 g刺梨经提取与精制后可得粗芦丁0.345 g、精制芦丁0.167 g。

2.2 标准曲线绘制

标准曲线的绘制如图3所示，标准曲线方程为y=11.575x+0.0224（R2=0.9945），说明其在浓度范围内具有良好的线性关系。

图1 标准曲线

2.3 芦丁测定结果

样品待测液在510 nm波长下吸光度为0.168，所以样品的含量为0.0127 mg/mL，经公式（1）计算得到精制芦丁中芦丁含量百分比为31.75%，因此刺梨中芦丁含量为17.67 mg/g。

2.4 样品稳定性实验结果

稳定性测定结果如表2所示，5 h内样品的吸光度值为6.0097～6.0104，变化不大，表示样品在5h内保持稳定。

表2 5h内样品吸光度值的变化

2.5 抑菌结果

如表3所示为芦丁抑菌性检测结果。3个菌种在不同质量浓度的实验药液下受到不同程度的抑菌，且随着实验药液浓度的增大，抑菌圈更为明显，表明芦丁具有明显的抑菌效果，且浓度越大，抑菌效果越好。对金黄色葡萄球菌抑菌效果明显，另外两种则极其微弱。4种浓度下，金黄色葡萄球菌的抑菌圈均大于其余两种菌，且抑菌效果为金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌＞枯草芽孢杆菌。

表3 实验药液对各个菌种抑菌圈的大小

3 结论

采用碱提取、酸沉淀法提取刺梨中的芦丁，取得了较好的效果。此方法具有提取率高、成本低廉、操作容易、提取纯度较高以及方法可靠准确等特点，具有很好的应用价值，对促进该药材的进一步推广具有重大意义。

芦丁对3个菌种均具有一定的抑菌作用，且随着质量浓度的增加，抑菌作用更为明显。芦丁对3种菌的抑菌大小为：金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌＞枯草芽孢杆菌。