提高乳酸菌耐胆盐能力的研究

王保根，庞泳，陈思贝

（黄淮学院生物与食品工程学院，河南驻马店 463000）

乳酸菌作为一种优良的益生元，在食品、养殖、保健和医药等方面得到了极大的推广和应用，尤其是在肠道微生物健康成为人们关注热点的今天，益生菌的开发成为热点研究内容[1]。乳酸菌想要发挥其益生作用，就必须定植于人体内环境[2]。这就要求乳酸菌能抵抗胃的强酸环境以及胆盐的毒性作用[3]。乳酸菌自身产乳酸，对于酸性环境有一定的抗性；而对于含有胆盐的环境，不同的乳酸菌表现出不同的抗性。可以确定的是，乳酸菌具有较强的耐胆盐能力，才能更好地在肠道发挥其益生作用[4]。

耐胆盐能力是筛选乳酸菌的重要标准之一，目前对于乳酸菌耐胆盐能力的研究已有诸多报道，但是对于乳酸菌耐胆盐的机制尚不完全清楚[5]。通过人为来提高乳酸菌耐胆盐的能力，不仅可以更好地利用这些生物资源，也能帮助人们探究乳酸菌耐胆盐的机制，以更好地发挥乳酸菌作为益生菌的作用，为人类的生产生活带来福音。

1 乳酸菌的耐胆盐机制

目前，人们对于乳酸菌耐胆盐的机制了解得还不全面，通过筛选具有较强耐胆盐能力的优良乳酸菌，可以对耐胆盐机制有一定的初步了解。目前的研究中，认为乳酸菌的耐胆盐机制大致可以分为3类：胆盐水解酶的作用、细胞的自我保护作用以及相关蛋白质的表达。

胆盐水解酶是一类广泛存在于哺乳动物肠道微生物中的胞内酶，由BSH基因编码。乳酸菌作为肠道微生物的优势菌群之一，本身可表达胆盐水解酶，进行胆盐修饰，将胆盐水解成游离的胆汁酸和氨基酸，以此来抵御胆盐对自身的毒性作用[6-9]。

从抑菌的机制来看，胆盐能够与细胞膜上的脂肪酸相互作用，改变了细胞膜的物理及化学性质，使细胞膜的结构和组成发生变化，从而使菌体破裂死亡[10-12]。乳酸菌在含有胆盐的环境中会发生一系列的应激反应，为维持细胞膜的正常生理功能，细胞膜的脂肪酸会发生变化，细胞膜表面蛋白的表达同样发生变化；同时乳酸菌也会利用小分子糖类物质，产生的ATP通过H+-ATP酶排出质子来调控细胞内pH值的动态平衡，以防止细胞酸化，保护乳酸菌在胆盐环境中的正常形态。

胆盐胁迫会使蛋白质折叠或变形，乌日娜[13]、安浩然[14]在含有胆盐的环境中培养乳酸菌并分析其蛋白质组的变化，发现多种蛋白质的表达发生了变化，推测其中多种蛋白质在乳酸菌耐胆盐方面发挥了重要作用。

2 提高乳酸菌株耐胆盐能力的措施

2.1 驯化培养

Chou等[15]研究发现，用胆盐选择性驯化乳杆菌的胆盐耐受性是有效的，经过几代胆盐驯化后得到的乳杆菌，耐胆盐能力比亲代乳杆菌强。通过驯化，使乳酸菌长期生活在最佳生存范围偏一侧的环境条件下，久而久之就会导致乳酸菌耐受曲线的位置移动。张颖[16]对分离自乳液及乳制品中的27株植物乳杆菌进行胆盐驯化培养，最终得到了具有较强耐胆盐能力的植物乳杆菌。

研究发现，对乳酸菌进行耐胆盐驯化培养是可行的，同时对乳酸菌进行其他方面的驯化培养也有类似的效果。宋照军等[17]通过耐硒筛选，确定嗜热链球菌为耐硒菌种，以浓度梯度法对其进行驯化，最终得到富硒菌种；马新新[18]从内蒙古传统酸菜汁中分离到32株乳酸菌，测定了其在不同糖浓度的MRS改良液体培养基中的生长状况，筛选出了两株耐高糖乳酸菌S5-1和S6-3，对其进行耐高糖驯化，使两株菌的耐糖能力分别提高至55%和50%；赵戎蓉[19]通过温度梯度法对乳酸菌株进行驯化，成功获得耐60 ℃高温的乳酸菌 ATCC 4356。

2.2 利用外源物质

益生菌除自身具有一定的耐胆盐能力外,与其同时使用的食物载体原料也会影响益生菌活性[20-21]。研究发现，一些谷物的提取物能明显增强乳酸菌耐胆盐的能力。

曾东等[22]将乳酸菌培养在含有玉米、豆粕、麦麸提取物以及1%胆盐的培养基中，发现乳酸菌的耐胆盐能力明显增强；靳志强等[23]将小米提取物添加到含有胆盐的培养基中，发现乳酸菌对胆盐的抗性明显提高。

他们推测，乳酸菌能够利用这些外源物质中的糖类物质产生ATP，通过H+-ATP酶排出质子来调控细胞内pH值的动态平衡，来防止细胞酸化。尽管不同的菌种在这些食物的提取液中，对胆盐的抗性是有差别的，但可以肯定的是，对胆盐的耐受性都有了一定程度的提高。

Kimoto等[24]将六株乳球菌接种在含有吐温-80的肉汤培养基中培养，发现其对抗胆汁的能力增强。实验中发现，在含有吐温-80的肉汤培养基中，乳球菌细胞膜的脂肪酸组成模式存在差异：在含有吐温-80的环境中生长的乳球菌，十六烷基脂肪酸和环丙烷脂肪酸明显降低，而十八碳烯酸含量明显增加。

虽然目前尚不清楚在对抗胆汁中起关键作用的脂肪酸的种类，但是可以肯定的是，吐温-80等非离子洗涤剂在一定程度上可以改变细菌脂肪酸的分布模式，从而使细胞膜的疏水性增强、通透性降低，以此来维持细胞的稳定，提高对胆汁的耐受力，Boever[25]、Conway[26]等也有类似的发现。

2.3 分泌胆盐水解酶（BSH）

胆盐水解酶对结合型胆盐的解离可以被看作一种解毒机制[27]，在乳酸菌消除胆盐对其自身影响的各种机制中，携有胆盐水解酶（BSH）活性被认为是乳酸菌为了适应肠道中的胆汁环境而进化出的一种应对策略[28-29]。有研究表明，菌体分泌的胆盐水解酶活力越髙，其在胆盐环境中的存活率越高[30-31]。

胆盐是由胆汁酸与牛磺酸、甘氨酸结合形成的钠盐或钾盐，即牛磺酸结合胆盐和甘氨酸结合胆盐。胆盐水解酶能够水解这种结合型胆盐，使胆酸和氨基酸链接的酰胺键打开，生成游离的胆汁酸和氨基酸。尽管目前仍不清楚胆盐水解酶特异性识别胆盐的具体部分，但无论是胆酸部分还是氨基酸，最终都是将其水解成对菌体影响较小的非结合型胆盐。

结合型胆盐会引起细菌表面疏水性及表面电势等表面特征的变化，使得细胞膜通透性和流动性发生变化，镶嵌在膜里面的酶系统发生紊乱，与之对应的功能不能正常运转。高浓度的结合型胆盐甚至能够直接溶解细胞膜中的脂质，造成膜蛋白分离，使细胞死亡[32]。从这点来说，被水解后的非结合型胆盐，胆酸部分虽然依旧可以通过反转扩散至细胞中对菌体造成毒性，但本身由于是弱酸，比结合型胆盐对细菌本身造成的毒害要少很多。

随着对胆盐水解酶研究的加深，人们逐渐认识到应该将具有高胆盐水解酶活性作为优良乳酸菌的筛选标准。毕洁等[33]通过基因工程将两个外源性胆盐水解酶表达在乳酸乳球菌中，发现其对胆盐的抗性大大增强。

当然，胆盐水解酶作为一种活性酶，其表达量越多，生成的胆酸也就越多。胆酸对于细菌本身是不利的，提高胆盐水解酶的底物专一性、减少对细菌有害胆酸的生成，依旧是今后研究的一大方向。

2.4 包埋

肠道中食物的存在也影响着乳酸菌在肠道中的存活率。Hou等人[34]建立了一种乳酸菌保护技术，将细菌细胞包裹在人工芝麻油乳剂中，以对抗模拟胃肠道环境。这种纯化芝麻油是由99%的石油、0.5%的磷脂、0.5%的蛋白质在70 ℃加热1 h后生成的。将脱脂乳培养的细菌包埋在芝麻油以及植物油组成的人工油乳剂中，发现在4～6℃环境下被包埋16 d的乳酸菌与未包埋相比存活率显著上升（从0.023%到5.450%）。结果表明，人工芝麻油乳状液可作为一种包封乳酸菌的生物胶囊。

3 结语

乳酸菌耐胆盐机制是一个极其复杂的过程，从基因的表达到外源物质的利用，乳酸菌通过一系列的手段来应对胆盐胁迫，以此来提高菌体本身对胆盐的耐受性。

目前，市场上已经存在很多乳酸菌益生产品，如酸奶、乳酸菌活菌胶囊等。虽然厂家标注了活菌数，但有学者检测过这些乳酸菌产品的活菌数，很多产品都是远小于厂家标出的数值。即使活菌数达到厂家所标注的数量，但每个人的肠胃环境又有着诸多区别，乳酸菌到达肠胃能否能发挥其益生作用还有待考究。

随着益生菌在疾病治疗方面的发展和对益生菌越来越高的要求，破解乳酸菌的耐胆盐机制十分重要。探究乳酸菌耐胆盐能力提高的过程事实上也是进一步探索乳酸菌耐胆盐机制的过程。随着蛋白质组学、基因组学、代谢组学的发展，研究者们将有更多的办法来探究乳酸菌在肠道环境中一系列生理变化。相信在不久的将来，人们能够更好地利用这些生物资源，充分发挥益生菌的益生作用，为人类造福。