TRPV4通道在膝骨关节炎软骨细胞中的功能表达*

（南京中医药大学附属医院 骨伤科，江苏 南京 210000)

膝骨关节炎（knee osteoarthritis,KOA）是一种累及整个关节的退行性疾病，其主要危险因素包括年龄、遗传、肥胖及损伤。该病的病理特征是软骨退化、骨赘形成、软骨下骨改变及滑膜炎症[1-2]。目前对KOA的病理机制尚未完全了解，研究主要集中在生物力学方向，软骨退化往往被认为是主要的发病原因[3]。关节软骨包括由蛋白多糖和胶原组成的水合细胞外基质，以及负责维持细胞外基质的软骨细胞。细胞外基质的代谢平衡受多种因素的影响，软骨细胞分泌的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）发挥重要作用[4]。

瞬时感受器电位离子通道家族（transient receptor potential,TRP）香草素受体亚家族成员Ⅳ型（transient receptor potential vanilloid receptor 4,TRPV4）是位于细胞膜上的非选择性阳离子通道，可被渗透压、机械刺激、佛波酯等多种因素激活[5-7]。活化的TRPV4引起Ca2+离子的大量涌入，随后激活细胞内信号通路[8]。近年来，大量的动物模型研究发现，TRPV4介导软骨细胞的代谢调节[9-11]，其中涉及的具体机制却尚未明晰。

TRPV4感受机械刺激并参与软骨降解的特点与KOA的病理机制十分契合。本实验提取KOA软骨细胞，并用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）刺激模拟KOA病程中的炎症环境，观察TRPV4通道的功能状态，以及TRPV4通道与MMP-1、MMP-3和MMP-13的联系，试图阐释TRPV4通道参与KOA软骨降解的病理机制。

1 资料与方法

1.1 主要试剂

DMEM高糖培养基、胎牛血清（美国Gibco公司），LPS、胶原酶Ⅱ型（美国Sigma公司），Trizol、逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测试剂盒（大连宝生生物工程有限公司），选择性TRPV4通道激动剂GSK-1016790A（美国Abcam公司），Fluo-4荧光染料（HY-D0041，美国MCE公司），HEPES缓冲液、MMP-1、MMP-3及MMP-13酶联免疫吸附试验试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。

1.2 仪器与设备

纯水仪（Synergy，美国Millipore公司），混合球磨仪（MM400，德国Retsch公司），垂直流超净工作台（ACB-4A1，新加坡ESCO公司），倒置显微镜（德国 Leica公司），核酸蛋白检测仪（Bio Photometer plus）、高速冷冻离心机（5810R/5417R）及逆转录PCR仪（德国 Effendorf Minispin公司），qRT-PCR 仪（7500，美国Applied Biosystems公司），激光扫描共聚焦显微镜（LSM710，德国Carl Zeiss公司），酶标仪（BioTek-ElX800，美国Biotech公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 人类软骨细胞原代培养 选取全膝关节置换术患者替换的软骨组织标本。患者知情同意，诊断符合美国风湿病学会分类标准，实验经南京中医药大学附属医院医学伦理委员会批准。软骨组织用含有双抗（青霉素100 u/ml和链霉素100 mg/L）的磷酸盐缓冲液冲洗2或3次，手术刀尖削取关节表面软骨，眼科剪剪碎成小块。0.1%Ⅱ型胶原酶消化60 min后，全培（20%胎牛血清的DMEM培养基，含1%青霉素和链霉素）终止消化。70目筛网过滤入离心管，1 500 r/min离心3 min，弃上清液。全培重悬后移入培养皿，37℃、二氧化碳CO2培养箱孵育，隔日换液。随后每5天换液，持续2周，获得人类原代软骨细胞。

1.3.2 LPS 干预软骨细胞模拟 KOA 炎症环境 将培养的KOA软骨细胞接种于24孔板，分别用浓度为0、1、10和100 ng/ml，以及浓度为 1和10 μg/ml的 LPS全培孵育24 h，或用浓度为1 μg/ml的LPS全培孵育0、4、8、12、24和48 h。

1.3.3 qRT-PCR 检测 采用 Trizol提取 LPS 干预后各组软骨细胞的总RNA，分光光度计测定RNA浓度和纯度，A260nm/A280nm比值在1.8～2.0可用于逆转录。总 RNA 加入 PrimeScript ® RT reagent Kit 10μl逆转录反应体系，按 37℃预变性 15min、85℃变性 5s的反应条件在PCR仪上行逆转录后，置入4℃冰箱保存。Oligo V7软件设计引物并交由上海生物工程技术服务有限公司合成，目的基因TRPV4正向引物序列：5'-ACCTT CAGCACCTTCCTCCT-3'，反向引物序列：5'-AGGGCGAT GAGCATGTTAAG-3'；内参照基因GAPDH正向引物序列：5'-ACAGCAACAGGGTGGGTGGTGGAC-3'，反向引物序列：5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'。参照SYBR Green PCR试剂盒说明书扩增，绘制熔解曲线。结果以GAPDH为内参半定量计算，采用2-△△Ct计算法（△Ct=样本Ct值-内参Ct值）对目的基因的相对表达量进行数据分析。

1.3.4 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA） 将KOA软骨细胞接种于6孔板，分为空白组、LPS组、LPS+TRPV4抑制剂组。LPS+TRPV4抑制剂组提前用TRPV4抑制剂孵育1h。LPS组、LPS+TRPV4抑制剂组用浓度为1μg/ml的LPS全培，空白组用正常细胞培养液全培。24h后收集上清液。ELISA检测LPS干预后各组上清液中MMP-1、MMP-3及MMP-13的表达水平。参照ELISA试剂盒说明书操作。

1.3.5 实时荧光钙成像 KOA 软骨细胞接种于共聚焦小皿，分为空白组、LPS组及LPS+TRPV4抑制剂组，各组干预方式如前所述。培养24h后，各组均用含 5μmol/L Fluo-4 的 HEPES 缓冲液孵育 30min。随后通过激光扫描共聚焦显微镜，实时加入工作浓度的TRPV4激动剂10μl，在495/518nm的激发波长处记录Ca2+流入胞内引起的荧光强度变化，持续记录2min。各组分别观察记录。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS的刺激增加TRPV4通道在人类KOA软骨细胞中的表达

空白组、1ng/ml LPS 组、10ng/ml LPS 组、100ng/ml LPS 组、1μg/ml LPS 组及10μg/ml LPS 组的 TRPV4 mRNA相对表达量分别为（0.996±0.065）、（1.102±0.093）、（1.948±0.060）、（2.335±0.147）、（3.041±0.195）和（1.745±0.206）。各组软骨细胞 TRPV4 mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义（F=149.52，P=0.000）。空白组与 1ng/ml LPS 组比较，差异无统计意义（t=1.213，P=0.237）；空白组与 10ng/ml LPS 组比较，10ng/ml LPS 组升高（t=10.719，P=0.000）；空白组与100ng/ml LPS 组比较，100ng/ml LPS 组升高（t=15.033，P=0.000）；空白组与 1μg/ml LPS 组比较，1μg/ml LPS组升高（t=22.989，P=0.000）；空白组与 10μg/ml LPS组比较，10μg/ml LPS 组升高（t=8.427，P=0.000）；10μg/ml LPS 组与 1μg/ml LPS 组比较，10μg/ml LPS组降低（t=14.562，P=0.000）。软骨细胞在 1μg/ml LPS的刺激下，TRPV4 mRNA相对表达量达到峰值。

使用浓度为1μg/ml LPS分别刺激人类KOA软骨细胞 0、4、8、12、24和48h，TRPV4 mRNA 相对表达量分别为（0.980±0.053）、（1.060±0.029）、（1.984±0.084）、（2.610±0.074）、（3.931±0.073）和（2.383±0.075）。各组软骨细胞TRPV4 mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义（F=1325.846，P=0.000）。0 h组与 4h组比较，差异无统计意义（t=1.878，P=0.073）；0h 组与 8h 组比较，8h 组升高（t=23.568，P=0.000）；0h组与12h组比较，12h组升高（t=38.263，P=0.000）；0h 组与 24h 组比较，24h 组升高（t=69.249，P=0.000）；0h 组与 48h 组比较，48h 组升高（t=32.864，P=0.000）；48h 组与 24h 组比 较，48h 组降低（t=36.385，P=0.000）。LPS 孵育 24h 后，TRPV4 mRNA相对表达量达到峰值。

2.2 TRPV4通道在人类KOA软骨细胞中功能性表达

使用实时荧光钙成像来观察TRPV4通道在人类KOA软骨细胞中的功能性表达。3组软骨细胞在20、40和60s的荧光强度经重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点间的荧光强度有差异（F=147.001，P=0.000）；②3组的荧光强度有差异（F=36.337，P=0.000）；③3组的荧光强度变化趋势有差异（F=262.411，P=0.000）。20s时，LPS 组与空白组比较，LPS组升高；LPS+抑制剂组与LPS组比较，LPS+抑制剂组降低。40s时，LPS组与空白组比较，LPS组升高；LPS+抑制剂组与LPS组比较，LPS+抑制剂组降低。60s时，LPS组与空白组比较，LPS组升高；LPS+抑制剂组与LPS组比较，LPS+抑制剂组降低。见表1和图1。

2.3 抑制TRPV4通道可以降低细胞培养上清中MMPs的表达

3组软骨细胞MMP-1、MMP-3及MMP-13的表达差异有统计学意义（P＜0.05）。LPS组的MMP-1与空白组比较，LPS组升高（t=9.306，P=0.000）；LPS+TRPV4抑制剂组的MMP-1与LPS组比较，LPS+TRPV4 抑制剂组降低（t=4.234，P=0.001）。LPS 组的MMP-3与空白组比较，LPS组升高（t=13.962，P=0.000）；LPS+TRPV4抑制剂组的MMP-3与LPS组比较，LPS+TRPV4 抑制剂组降低（t=8.690，P=0.000）。LPS 组的MMP-13与空白组比较，LPS组升高（t=19.108，P=0.000）；LPS+TRPV4抑制剂组的MMP-13与LPS组比较，LPS+TRPV4抑制剂组降低（t=10.620，P=0.000）。见表2。

表1 各组软骨细胞20、40和60 s实时荧光强度比较（±s）

表1 各组软骨细胞20、40和60 s实时荧光强度比较（±s）

注：①与空白组比较，P ＜0.05；②与LPS组比较，P ＜0.05。

组别 20 s 40 s 60 s空白组0.942±0.109 1.094±0.559 1.350±0.059 LPS组1.958±0.267① 4.412±0.354① 5.556±0.101①LPS+TRPV4抑制剂组1.220±0.172② 2.278±0.318② 2.988±0.088②F 值 36.747 185.501 3 143.136 P值 0.000 0.000 0.000

图1 TRPV4通道在人类KOA软骨细胞中的功能性表达

表2 各组软骨细胞MMP-1、MMP-3及MMP-13水平比较 （ng/ml，±s）

表2 各组软骨细胞MMP-1、MMP-3及MMP-13水平比较 （ng/ml，±s）

注：①与空白组比较，P ＜0.05；②与LPS组比较，P ＜0.05。

组别 MMP-1 MMP-3 MMP-13空白组27.996±4.726 47.332±3.169 5.952±1.742 LPS组60.468±7.186① 73.134±2.507① 28.434±2.461①LPS+TRPV4抑制剂组45.694±4.162② 57.074±3.047② 15.938±1.137②F值 43.418 99.405 183.283 P值 0.000 0.000 0.000

3 讨论

本研究首次证实，TRPV4机械敏感离子通道在人类软骨细胞的表达。此外，用LPS持续刺激以模拟KOA的炎症环境，观察TRPV4的功能性表达，以及是否与MMPs家族存在联系。结果发现，在LPS的刺激下，TRPV4的基因表达增加，浓度为1μg/ml的LPS能最大限度增加TRPV4的表达，同时，TRPV4的表达随刺激时间的增多而增加，在24h达到最高值，随后出现降低，据猜测，这种降低有可能是LPS毒性对细胞活性存在影响。实时荧光钙成像分别观察20、40和60s的荧光强度：LPS组荧光强度增加，与空白组比较，差异有统计学意义；LPS+TRPV4抑制剂组荧光强度弱于LPS组，差异有统计学意义。结果证明，骨性关节炎的炎症环境在细胞层面上可能会导致Ca2+内流的强度变化。伴随着TRPV4表达变化，相应细胞培养上清液中MMP-1、MMP-3及MMP-13存在变化。LPS组MMP-1、MMP-3及MMP-13较空白组升高；而LPS+TRPV4抑制剂组较LPS组表达降低。由此可知，KOA软骨细胞中的TRPV4可能通过影响MMPs的表达水平参与软骨降解的过程。

TRPV4通道最早是从大鼠的肾脏中分离出来的，并在软骨、骨、滑膜等多种肌肉骨骼组织中广泛表达，目前的研究主要聚焦于不同的传入感觉神经元，如伤害感受神经纤维和背根神经节[12]。KOCHUKOV等[13]证实，TRPV4在人类的滑膜细胞存在表达，并且该通道的功能表达可以被肿瘤坏死因子-α增强，因此将滑膜细胞的病理反应与炎症状态联系起来。本研究首先发现，TRPV4在人类KOA软骨细胞中表达，同时，软骨细胞在LPS，一种革兰阴性菌细胞壁中的内毒素，可引起炎症。有证据表明LPS可能在关节炎的发病机制中起着重要的作用[14]，并被单独或与胶原蛋白联合应用于关节炎模型的诱导刺激，TRPV4的表达随LPS浓度和刺激时间的增加而增加。据此推测，TRPV4在KOA中的表达可能与炎症程度的轻重有关。

与TRP家族的其他成员相比，TRPV4具有机械刺激激活的特点，被认为是介导机械痛觉过敏的媒介。例如，在慢性压迫大鼠背根神经节后，TRPV4通道开放介导NF-κB信号通路的激活，并最终参与机械痛敏的形成[15]。众所周知，NF-κB信号通路是参与KOA的主要信号通路之一，在MMPs的调控中起重要作用。TRPV4介导的Ca2+内流激活细胞内信号通路，对维持骨稳态至关重要[16]。学者TORZILLI等[17]发现，在体外软骨负荷模型中，机械负荷能增加MMPs的表达。上述研究提示，无论是机械刺激这样的病理因素，还是软骨降解破坏这样的病理过程，TRPV4均与KOA十分契合。本实验通过测量Ca2+内流验证KOA软骨细胞TRPV4通道的功能性表达。结果显示：空白组的荧光强度变化并不显著；LPS组明显增加；LPS+TRPV4抑制剂组稍有增加，但增加的强度弱于LPS组。该差异证明KOA软骨细胞中存在着TRPV4的功能变化。

本研究试图探讨在KOA的炎症环境中TRPV4的激活是否能调节MMPs的表达。MMPs是一族肽链内切酶，能降解ECM中的多种底物。大量的研究表明，MMPs在关节软骨破坏中起着关键作用。在各种MMPs中，MMP-1和MMP-13是胶原酶，MMP-3是基质降解酶，MMP-1和MMP-13是导致胶原蛋白整体降解的主要因素。在本研究中，TRPV4的抑制可下调MMP-1、MMP-3及MMP-13的表达，提示KOA病程中TRPV4与MMPs有关，抑制TRPV4可能是抑制软骨降解的有效方法。

本研究展示TRPV4通道在人类KOA软骨细胞中的功能变化并参与调控MMP-1、MMP-3及MMP-13的表达，为KOA因生物力学因素导致软骨破坏降解提供了新的解释，为抑制KOA病程中软骨破坏提供了新的靶点。尽管如此，本研究仍有不足。首先，实验未能在动物模型上加以验证；其次，TRPV4介导软骨降解的具体机制缺乏探究。今后进一步的研究将围绕TRPV4通道开放后下游信号通路的传导展开。