结直肠癌患者外周血和癌组织中Vδ1 T和Vδ2 T细胞研究

（衢州市人民医院 肿瘤放疗科，浙江 衢州 324000）

结直肠癌是西方国家癌症相关死亡的第2大主要原因[1]。当前，用于晚期结直肠癌治疗的主流药物包括氟尿嘧啶、卡培他滨、奥沙利铂等，可以单独使用，也可两种联合使用[2]。由于其毒性和不良事件，这些治疗药物的应用均受到限制。进一步了解结直肠癌的发病机制，可为新药研究和个体化治疗提供支持。

γδ T细胞是不同于传统αβ T细胞的一群T淋巴细胞，占人体外周血CD3 T细胞的1%～10%[3]，γδT细胞一直被视为机体固有免疫系统的重要成员之一[4]。γδT细胞可进一步分为2个细胞亚群：Vδ1 T细胞（主要分布于上皮性相关的淋巴组织）和Vδ2 T细胞（主要分布于外周血）[5]。Vδ2 T细胞主要参与机体对肿瘤的免疫监视和对病原体侵袭的防御反应[6-9]，是γδT细胞发挥抗感染和抗肿瘤免疫作用的主要亚群；而Vδ1 T细胞主要具有免疫调节功能[10]，目前认为与某些肿瘤，如乳腺癌的免疫逃逸相关。

γδT细胞因其独特的组织相容性复合体（MHC）非限制性识别肿瘤抗原的特点而成为肿瘤免疫治疗的研究热点。本实验通过观察结直肠癌患者外周血和肿瘤组织γδ T细胞及各亚群的比例及功能变化情况，探讨γδT细胞及各亚群在结直肠癌发病中的可能作用，为未来以γδT细胞为基础免疫疗法的应用提供一些科学依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年9月30日—2017年10月31日衢州市人民医院接受手术治疗的结直肠癌患者20例为癌症组。所有入组者术前均未接受任何化学治疗、放射治疗或免疫治疗；于术中收集癌症组癌组织和癌旁组织标本，均经过组织病理学诊断证实为结直肠癌。同时收集该院健康体检的20例作为对照组。癌症组的平均年龄（51.09±13.26）岁，对照组的平均年龄（49.85±15.83）岁。标本的收集符合本院伦理委员会的要求。

1.2 主要试剂

RPMI 1640培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司，FITC-抗人TCRγδ（IMMU510）以及抗人TCR-γδ单克隆抗体购自美国Beckman Coulter Immunotech公司，APC-c抗人CD3（HIT3a）、FITC-抗 人 TCR Vδ2（B6） 购自美国 Biolegend公司，FITC-抗人TCR Vδ1（TS8.2）购自美国Pierce公司，Cell TraceTMCFSE 细胞增殖 Kit 购自美国 Invitrogen公司，白细胞介素-2购自日本United Pharmaceutical（Far East）Limited 公司。

1.3 外周血单个核细胞获取方法

清晨抽取两组的外周血，以枸橼酸钠抗凝管收置；并以无菌RPMI 1640培养基稀释1倍。按稀释血液∶淋巴细胞分离液2∶1的比例计算淋巴细胞分离液体积，并于离心管中加入适量淋巴细胞分离液，随后将稀释后的外周血缓慢加入离心管中，并确保稀释血置于淋巴细胞分离液上层，2 000 r/min 离心 20 min。离心后的血液分为4层，从上至下依次为：血清层、白膜层、淋巴细胞分离液层和红细胞层。采用吸管轻轻吸取中间白色的淋巴细胞白膜层，加入预装10 ml无菌RPMI 1640 培养基的离心管中，1 800 r/min 离心 15 min。弃尽无菌 RPMI 1640 培养基，以 10 ml无菌 RPMI 1640 培养基重悬细胞沉淀，1 500 r/min 离心 8 min。获取的细胞即为外周血单个核细胞，可用于后续实验。

1.4 T细胞获取方法

结直肠癌组织以机械研磨的方法获得T细胞，具体方法参见文献[11]。

1.5 结直肠癌组织及外周血γδT细胞的培养

结直肠癌组织以机械研磨的方法获得T细胞。抗凝外周血以Ficoll-PaqueTMPREMIUM分离获得外周血单个核细胞。所获T细胞及外周血单个核细胞以固相包被抗人TCR-γδ单克隆抗体（0.25 μg/cm2）进行刺激，所用培养基为含200 IU/ml白细胞介素-2及10%胎牛血清的RPMI 1640。细胞置于37℃、5%二氧化碳CO2条件下培养2～4周，其间每2～3天进行传代。

1.6 表面分子的免疫荧光染色

收集约1×106个的外周血单个核细胞和T细胞，以磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）（含1%牛血清白蛋白的PBS）洗涤1次。随后采用50 μl PBS重悬细胞，根据抗体说明书要求加入适量荧光标记抗体，4℃避光孵育20 min。PBS洗涤2次，重悬于500 μl含1%多聚甲醛的PBS固定液中用于流式细胞仪检测。

1.7 免疫抑制功能检测

采用流式分选方法获取经扩增后的Vδ1 T细胞和对照组外周血 Naïve CD4 T 细胞。分选获取的 Vδ1 T细胞和对照组外周血Naïve CD4 T细胞经流式细胞术检测纯度 ＞90%。Vδ1 T 细胞抑制 Naïve CD4 T 细胞增殖能力检测时，需预先在96孔板中包被1 μg/mlCD3抗体及2 μg/ml CD 28 抗体，并放置在 37℃孵箱中孵育至少 2 h ；实验过程中，Naïve CD4 T 细胞按产品说明书进行 CFSE 染色，染色结束后 Naïve CD4 T 细胞以 RPMI 1640完全培养基重悬后，加入96孔板中，进行Vδ1 T细胞抑制 Naïve CD4 T 细胞能力检测时，将Vδ1 T 细胞和Naïve CD4 T细胞按1∶1比例加入96孔板中；各组细胞在37℃孵箱中孵育5 d后收取细胞用于流式细胞仪检测。

1.8 统计学方法

数据分析采用SPSS 16.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血γδ T细胞比例

对照组和癌症组外周血γδ T细胞比例为（5.7±1.9）%和（5.5±2.3）%，两组比较，差异无统计学意义（t=0.300，P =0.766）；对照组和癌症组外周血Vδ1 T细胞比例为（1.1±0.5）%和（3.2±0.9）%，两组比较，差异有统计学意义（t=2.702，P=0.004），癌症组外周血Vδ1 T细胞比例升高；对照组和癌症外周血Vδ2 T细胞比例为（4.5±1.5）%和（2.2±0.7）%，两组比较，差异有统计学意义（t=1.366，P=0.006），癌症组外周血Vδ2 T细胞比例降低。见图1。

2.2 癌症组癌旁组织和癌组织γδ T细胞比例

癌旁组织和癌组织γδT细胞比例为（6.1±2.1）%和（5.9±2.2）%，两者比较，差异无统计学意义（t=0.294，P=0.770）；癌旁组织和癌组织 Vδ1 T细胞比例为（1.1±0.5）%和（3.6±1.2）%，两者比较，差异有统计学意义（t=1.059，P=0.008），癌组织 Vδ1 T细胞比例升高；癌旁组织和癌组织Vδ2 T细胞比例为（5.5±2.1）%和（2.8±1.4）%，两者比较，差异有统计学意义（t=2.248，P=0.005）；癌组织 Vδ2 T 细胞比例降低。见图2。

2.3 外周血及癌旁组织、癌组织γδT细胞增殖能力

对照组外周血γδT细胞经抗体扩增后，总γδT细胞比例为（86.8±14.2）%，Vδ1 T 细胞比例为（6.4±4.8）%，Vδ2 T细胞比例为（74.2±18.5）%；癌症组外周血γδT细胞经抗体扩增后，总γδT细胞比例为（83.5±11.5）%，Vδ1 T 细胞比例为（41.5±8.4）%，Vδ2 T细胞比例为（28.4±15.3）%。与对照组比较，癌症组总γδT细胞的扩增能力无改变（P＞0.05），而不同亚型的γδT细胞，即Vδ1 T细胞的扩增能力提高（t=10.529，P=0.007），Vδ2 T 细胞的扩增能力降低（t=8.532，P=0.004）。癌症组癌旁组织 γδT 细胞经抗体扩增后，总γδT细胞比例为（85.3±18.3）%，Vδ1 T 细胞比例为（24.5±12.8）%，Vδ2 T 细胞比例为（55.3±15.2）%；癌症组癌组织γδT细胞经抗体扩增后，总γδT细胞比例为（84.9±12.6）%。Vδ1 T 细胞比例为（60.6±13.7）%，Vδ2 T 细胞比例为（21.8±12.6）%。与癌旁组织比较，癌组织总γδ T 细胞的扩增能力无改变（t=0.081，P=0.936），而不同亚型的γδ T细胞，即Vδ1 T细胞的扩增能力提高，而Vδ2 T细胞的扩增能力降低。同时，结果显示，癌症组癌旁组织Vδ1 T细胞的扩增能力高于对照组外周血 Vδ1 T 细胞的扩增能力（t=10.315，P=0.004），而Vδ2 T细胞的扩增能力低于对照组外周血Vδ2 T细胞的扩增能力（t=8.734，P=0.002）。见图3。

图1 两组外周血γδ T细胞比例

图2 癌症组癌旁组织和癌组织γδ T细胞比例

2.4 两组Vδ1 T细胞的免疫抑制能力

对照组外周血Naïve CD4细胞单独的增殖能力为（90.7±15.7）%，Naïve CD4细胞与对照组外周血Vδ1 T细胞共培养后，Naïve CD4 细胞单独的增殖能力为（67.5±11.4）%，Naïve CD4细胞与癌症组外周血Vδ1 T细胞共培养后，Naïve CD4细胞单独的增殖能力为（44.8±8.8）%，Naïve CD4 细胞与癌旁组织 Vδ1 T细胞共培养后，Naïve CD4细胞单独的增殖能力为（52.8±7.9）%，Naïve CD4 细胞与癌组织 Vδ1 T 细胞共培养后，Naïve CD4细胞单独的增殖能力为（33.6±7.7）%；癌症组外周血和癌组织浸润Vδ1 T细胞的免疫抑制功能较癌旁组织增强（t=6.067和5.179，P=0.002和0.003），癌旁组织Vδ1 T细胞的免疫抑制功能亦增强（t=4.872，P=0.003），但仍低于癌症组外周血和癌组织的Vδ1 T细胞免疫抑制能力。见图4。

图3 外周血及癌旁组织、癌组织γδ T细胞的增殖能力

图4 结直肠癌患者Vδ1 T细胞免疫抑制能力

3 讨论

本研究结果显示与对照组比较，癌症组外周血、癌旁组织和癌组织总γδT细胞比例并未出现变化。γδT细胞主要分为2个细胞亚群：Vδ1 T细胞和Vδ2 T细胞[5]。对γδT细胞及其不同亚群的分析结果显示，癌症组外周血和癌组织的γδT细胞比例并未出现变化，而对不同亚群的分析结果显示，Vδ1 T细胞比例升高，Vδ2 T细胞比例降低。且在体外经抗TCRγδ抗体刺激及IL-2存在条件下培养14 d后，对照组和癌症组外周血、癌旁组织和癌组织的VδT细胞纯度均可达80%以上，然而对照组的VδT细胞以Vδ2 T细胞为主，Vδ1 T细胞只占很小的一部分，癌症组癌旁组织扩增后Vδ1 T细胞比例有一定程度升高，但仍以Vδ2 T细胞为主，而癌症组外周血和癌组织的VδT细胞则以Vδ1 T细胞为主，Vδ2 T细胞只占很小的一部分。进一步功能实验发现，结直肠癌患者外周血Vδ1 T细胞的免疫抑制功能增强。至此，笔者的研究结果初步提示，癌症组外周血和癌组织中Vδ1 T细胞和Vδ2T细胞比例的分布不平衡，以及Vδ1 T细胞的异常活化状态和抑制功能的增强，使癌症组机体处于免疫抑制状态，从而有利于肿瘤逃避免疫监视，进而促进肿瘤的发生和发展。

过继免疫疗法一直被研究者关注并用于癌症的治疗[12]。过继免疫治疗是将供体的淋巴细胞转移给受体，增强其细胞免疫功能，使其获得抗肿瘤免疫力。γδT细胞因其独特的MHC非限制性抗原识别能力，同时兼具NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和T辅助细胞（Th）的功能特点，因此成为肿瘤免疫治疗的研究热点[13]。γδT细胞包括2个主要的亚群，即Vδ1 T 细胞和Vδ2 T 细胞，其中的 Vδ2 T 细胞主要参与机体对肿瘤的免疫监视和对病原体侵袭的防御反应，因此Vδ2 T细胞过继治疗研究越来越多，多种肿瘤患者在化疗后的合适时间给予Vδ2 T细胞和唑来磷酸可大幅度提高抗肿瘤疗效[14]。同时，研究者发现Vδ1 T细胞在肿瘤患者体内主要发挥免疫抑制功能进而促进肿瘤的发展[15]。目前关于γδT细胞在结直肠癌的研究还很少，且很少有研究同时关注外周血、癌旁组织和癌组织。本研究亦希望通过对结直肠癌患者外周血、癌旁组织和癌组织中γδT细胞的研究为未来结直肠癌的过继免疫治疗提供一定的科学依据。

本研究通过流式细胞术检测发现，与对照组比较，癌症组外周血Vδ1 T细胞比例升高，Vδ2 T细胞比例降低。除外周血外，本研究还进一步对癌组织中γδ T细胞及其亚群进行分析，结果与外周血一致，与癌旁组织比较，癌组织Vδ1 T细胞比例升高，Vδ2 T细胞比例降低。此外，本研究还发现，在体外经扩增后癌症组外周血和癌旁组织、癌组织的Vδ T细胞均以Vδ1 T细胞为主，Vδ2 T细胞只占很小的一部分。这一结果与结直肠癌患者外周血VδT细胞是以Vδ1 T细胞为主相一致。正如前言部分所介绍，Vδ2 T细胞是一种具有肿瘤杀伤功能的细胞，而Vδ1 T细胞则以免疫抑制功能为主。据此，本研究进一步对Vδ1 T细胞的免疫抑制功能进行研究，结果显示，结直肠癌患者外周血和癌旁组织、癌组织的Vδ1 T细胞免疫抑制功能增强。

综上所述，本研究结果初步提示，癌症组外周血和癌组织Vδ1 T细胞和Vδ2 T细胞比例失衡，从而使患者机体处于免疫抑制状态，这可能是结直肠癌逃避机体免疫监视的途径之一。癌症组外周血γδT细胞及不同细胞亚群的比例及功能变化可能与结直肠癌的发生和发展密切相关。