miR-144在骨质疏松患者护理过程中的变化和对骨质疏松的作用研究

葛 萌

随着世界人口老龄化现象逐渐加重，骨质疏松(OP)的发病率逐年增加[1]。骨质疏松作为常见的骨科疾病，其主要临床表现为骨量急剧降低、骨微观结构受损严重、骨脆性增加，且好发于老年人和绝经后女性[2]。据统计，全球范围内，年龄大于50岁的人群中，1/3的女性患有骨质疏松，而1/5的男性患有骨质疏松[3]。目前我国骨质疏松患者总数高达1.4亿，严重影响患者的健康和生活质量[4，5]。骨质疏松的发病原因主要是骨吸收与骨形成失衡，成骨细胞的分化和功能活性在骨形成中发挥重要作用，大多数成骨细胞是由骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)分化而来[6]。因此，骨髓间充质干细胞的活性和成骨分化在骨质疏松的发生和发展中起着至关重要的作用。

microRNAs(miRNAs)是一类广泛存在于真核生物体中、长度约为22～25个核苷酸的、内源性非编码单链RNA[7]。miRNA对靶基因进行转录后调控，miRNAs可通过与靶mRNA特异性结合从而诱导其降解或翻译抑制，进而能够参与多种疾病的发生和发展过程[8]。近年来相关研究表明，一些miRNAs可参与骨形成过程，且调控骨相关疾病的发生和发展[9～11]。因此，本文研究miR-144在骨质疏松患者护理过程中的变化及其对骨质疏松作用，为进一步研究骨质疏松及相关护理提供一个新方向和新思路。

1.资料与方法

1.1 临床样本 选取2018年1月至12月在我院接受治疗的60例骨质疏松患者作为研究组，年龄范围为50～80岁，平均年龄(57.13±13.45)岁，男性30例，女性30例。纳入标准:年龄大于50岁；符合《中国人骨质疏松症建议诊断标准》(第二稿)中骨质疏松相关诊断标准[12]；精神正常；依从性高。排除标准:患有影响骨代谢的疾病；近期服用可能干扰骨代谢的药物；恶性肿瘤患者；合并有心脑血管严重疾病者；肝、肾功能检查异常者。此外，选取同期在我院进行健康体检的60例健康志愿者作为对照组。

于清晨收集两组患者空腹静脉血6ml，应用超高速离心机(Thermo，美国)，室温条件下，转速为12000rpm，离心10min，以分离血清，将血清置于-80℃超低温冰箱(Thermo，美国)中保存。此外，收集骨质疏松患者接受护理治疗前、治疗2周、4周、6周、8周时的血清样本，检测miR-144的表达情况。本研究经我院伦理委员会批准，所有患者均自愿参与本课题并签署书面知情同意书。

1.2 护理干预方法 60例骨质疏松患者接受常规护理干预和综合护理。常规护理主要包括：①密切观察患者病情，预防并发症的发生；②积极与患者沟通，及早了解患者心理变化，并为其排解担忧；③指导患者正确饮食，嘱患者进食钙含量丰富的食物，并提醒患者按时服药；③对患者进行防跌倒有关策略指导。

综合护理干预，主要包括：①多与患者进行沟通和交流，反复讲解患者日常生活中需要注意的事情，及时给予有效的指导，加强患者信心；②定期针对患者开展健康知识讲座，帮助患者了解骨质疏松的病因及治疗的重要性；③指导患者进行适当的慢跑等锻炼，以进行功能锻炼；④指导患者如何缓解疼痛，如进行适当的放松训练及转移注意力等；⑤出院后针对患者情况制订详细的干预计划，对患者运动、饮食及用药情况进行电话监督和提醒。

1.3 细胞培养 人BMSCs购于中国赛业公司，采用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养液(Hyclone，美国)进行细胞培养，并将细胞置于37℃和5%CO2的培养箱(Thermo，美国)中培养。每3天更换新鲜培养液，待细胞汇合度达到90%时，进行细胞传代。

1.4 细胞转染 将人BMSCs接种于细胞培养板中(康宁，美国)，应用转染试剂Lipo2000(Invitrogen，美国)和无血清Opti培养基(Hyclone，美国)进行miRNA转染，分组分别为miR-144mimic、mimic-NC、miR-144 inhibitor、inhibitor-NC组，24h后进行后续实验。

1.5 实时定量聚合酶链式反应(real time qPCR) 应用TRIzol溶液(Thermo，美国)裂解细胞RNA，充分裂解后，提取总RNA。加入10μl体积的DEPC水溶解RNA沉淀后，置于Nanodrop仪器检测RNA纯度和浓度。参照逆转录试剂盒(ABI，美国)说明书，将RNA逆转录成cDNA。应用Real-time PCR仪(ABI，美国)，采用SYBR染料(罗氏，德国)检测miR-144的表达情况。

1.6 CCK-8实验 将人BMSCs接种于96孔板中(康宁，美国)，细胞转染miR-144后，进行CCK-8实验检测细胞活性。96孔板每孔加入10μl体积的CCK-8溶液和100μl体积的无血清培养基，避光孵育1h后，将孔板置于酶标仪(TECAN，瑞士)，在波长为450nm处检测吸光度值(OD)。

1.7 细胞成骨诱导分化 待人BMSCs汇合度达到约50%时，将人BMSCs向成骨方向诱导分化，采用含有50μg/ml抗坏血酸、10mmol/Lβ-磷酸甘油和10-7mmol/L地塞米松的DMEM培养液(Hyclone，美国)，每3天更换新鲜培养液，诱导21天后进行相关实验。

1.8 碱性磷酸酶(ALP)染色 人BMSCs向成骨方向诱导分化后，用PBS清洗细胞，并用4%多聚甲醛(索莱宝，中国)室温条件下固定30min。参照试剂盒说明书(南京建成，中国)，孵育ALP染色孵育液。应用去离子水洗涤3次，留少量的液体，并将细胞置于倒置光学显微镜(Olympus，日本)下观察，并拍照。

1.9 统计学方法 所有数据均表示为均数±标准差，所有实验结果均重复至少3次，数据均采用Graphpad软件进行处理，两组间比较采用配对t检验。P<0.05时，认为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 骨质疏松患者中miR-144的表达 与正常对照组(n=60)相比，骨质疏松患者(n=60)血清中miR-144的表达显著降低，差异具有统计学意义(P=0.0004，图1)。

图1 正常人和骨质疏松患者血清中miR-144的表达

2.2 骨质疏松患者接受护理过程中miR-144的表达变化 与护理干预前相比，骨质疏松患者(n=60)接受护理干预过程中，患者血清中miR-144的表达逐渐增高，且在护理8周时表达最高(图2)。

图2 骨质疏松患者接受护理干预过程中miR-144的表达情况

2.3 miR-144对人BMSCs活性的影响 CCK-8实验结果表明，miR-144mimic显著提高人BMSCs活性，而miR-144 inhibitor显著抑制人BMSCs活性，差异具有统计学意义(P=0.0012和P=0.0011，图3A和图3B)。

图3 miR-144调控人BMSCs活性

2.4 miR-144对人BMSCs成骨分化的影响 ALP染色结果表明，miR-144mimic显著促进人BMSCs向成骨方向分化，而miR-144 inhibitor显著抑制人BMSCs向成骨方向分化(图4A和4B)。

图4 miR-144调控人BMSCs成骨分化能力

3.结论

miRNAs是内源性非编码单链RNA，其可以调控人类约1/3基因的表达[13]。据报道，miRNAs在骨形成和骨发育过程中发挥重要的调控功能，进而参与骨质疏松等骨相关疾病的进程[14]。例如，周翔等人发现miR-590抑制老年骨质疏松患者BMSCs成骨分化，敲减miR-590可能成为临床治疗老年骨质疏松的新方法[15]。张扬等人发现，miR-98-5p对间充质干细胞成骨分化和小鼠骨缺损恢复有促进作用，通过调控miR-98-5p表达的方式或许可以用于治疗日常病理性骨质疏松和促进骨损伤恢复[16]。然而，针对miRNA与骨质疏松的发生和发展及患者接受护理干预的研究并不完善。因此，本文研究miR-144在骨质疏松患者护理过程中的变化及其对骨质疏松作用，为进一步研究骨质疏松及相关护理提供一个新方向和新思路。

本研究发现，与正常对照组相比，骨质疏松患者血清中miR-144的表达显著降低；骨质疏松患者接受护理干预过程中，患者血清中miR-144的表达逐渐增高，且在护理8周时表达最高；CCK-8实验结果表明，miR-144mimic显著提高人BMSCs活性，而miR-144 inhibitor显著抑制人BMSCs活性；ALP染色结果表明，miR-144 mimic显著促进人BMSCs向成骨方向分化，而miR-144 inhibitor显著抑制人BMSCs向成骨方向分化。因此，我们认为miR-144在骨质疏松患者中表达降低，护理干预后miR-144的表达显著升高，且其能够调控人BMSCs活性和成骨分化能力。

综上所述，miR-144在骨质疏松患者中表达降低，护理干预后miR-144的表达显著升高，且过表达miR-144能够提高人BMSCs活性和成骨分化能力，通过调控miR-144表达可能可以治疗骨质疏松，为临床骨质疏松的治疗提供新的思路。