地中海贫血基因检测研究进展

施建刚

广西壮族自治区贵港市人民医院检验科，广西贵港 537100

地中海贫血是由于珠蛋白基因突变而引起的一组常染色体隐形遗传病[1]。目前，地中海贫血的治疗方法正处于临床研究的过程中，难以通过有效手段来达到根治的效果，因此需要通过婚前检查、产前筛查、遗传信息指导等方面来控制遗传。特别是针对携带了地中海贫血基因的孕妇，应加强妊娠早期的产前基因检查，提高地中海贫血基因的诊断率，在合理的调控下减少贫血儿的出生人数，是目前最为有效的预防手段[2]。在此，现对地中海贫血基因突变检测的研究进展作出如下综述。

1 地中海贫血的分子基础

1.1 α-地中海贫血

α-地中海贫血是现阶段最为常见的单基因遗传病，其发病机制在于珠蛋白基因缺失的影响，或者是缺陷使α-珠蛋白链合成受到抑制所形成的[3]。从基因簇来看，α-珠蛋白基因位于16号染色体末端16pl3.3点位上，因此也将α-地中海贫血分为两个不同的种类，其中包括：（1）缺失型α-地中海贫血：常见的为α0地中海贫血和α+地中海贫血，前者表现为缺失2个α基因，后者表现为缺失1个α基因；（2）非缺失型α-地中海贫血：基因样本中缺失了小部分的碱基或者基因发生点突变的情况。在两种不同的α-地中海贫血类型中，已经确定了38种为α-地中海贫血缺失类型，而基因点突变的非缺失α-类型约有34种[4]。

1.2 β-地中海贫血

β-地中海贫血是一种β链在合成过程中受到抑制作用而形成的一组血红蛋白病，其珠蛋白基因位于11号染色体短臂11pl15上，若是患者本身存在先天性遗传基因缺陷的问题，就会因血红蛋白症而引发溶血性贫血[5]。临床的相关调查数据显示，目前大部分的β-地中海贫血均通过基因突变引起的，少部分是由于基因缺失而形成。β0珠蛋白的作用在于障碍性贫血的生成，而基因突变则会导致β链出现抑制效果，难以正常合成，最终无法生成β链；β+珠蛋白的作用即使也会一直β链的合成，但仍可以生成部分β链；非典型的β-珠蛋白则会由于分子缺陷的影响，导致β-珠蛋白基因启动出现异常，最终在基因表达方面也会受到影响[6]。

2 地中海贫血的基因研究检测方法

2.1 质谱检测技术

2.1.1 聚合酶链式反应技术 聚合酶链式反应是一种用于DNA片段检测的分子生物学技术，能够实现在生物体外进行DNA的复制功效。目前，聚合酶链式反应技术已广泛应用于地中海贫血的基因检测中，并在此基础上研究了多种类型的检测方法，进一步提高了临床地中海贫血的基因检出率。而常见的聚合酶链式反应新技术包括：（1）基因特异性PCR-溶解曲线分析技术：Danjou等[7]在β珠蛋白基因突变的患者中应用基因特异性PCR-溶解曲线分析技术，通过加入新型的荧光染料来了解聚合酶链的动态反应变化过程，在研究中记录荧光值变化的溶解曲线，以每5秒的时间间隔为宜，将所得的曲线图用于β地中海贫血基因突变的观察中。结果显示，基因特异性PCR-溶解曲线分析技术的应用成本低，在实际操作的过程中无需应用荧光标记探针，并且具有通量高、污染轻、质控便捷、自动化程度高等特点。（2）单管多重聚合酶链式反应技术结合RDB技术：Du等[8]采集了国内常见的缺失型α-地中海贫血基因突变的诊断标本，并选取82例作为研究对象，分析单管多重的聚合酶链式反应技术对常见的地中海贫血基因突变的RDB法，并根据扩增图谱和显色斑点等数据来判断标本的突变类型，以将产前诊断标本与引产或者出生后的胎儿基因研究进行结果对比。结果显示，α-地中海贫血产前诊断的结果与胎儿脐带血的HbBart"s的定量结果基本一致。

2.1.2 高分辨溶解曲线分析技术 高分辨溶解曲线分析技术在临床上的应用中具有灵敏度高、特异性明显等优点，与定量探针法突变分析或者其他检测技术手段相比，高分辨溶解曲线分析技术的灵敏度可高达0.1～0.8，特别是在多点位基因突变或者样本量较大的点位筛查中，解决了传统检测技术中性价比低、耗时长等问题，因而应用面更为广泛，成为了近年来国内外遗传学研究的重点方向之一。王晶晶等[9]在我国国内常见的β-地中海贫血基因突变患者中应用高分辨溶解曲线分析技术，选择52例正常研究对象作为对照组，45例已知基因突变型患者作为观察组；其中对照组曲线分析结果显示基因筛查的区域中存在三个常见的SNPs，观察组曲线分析结果显示所有突变均能正常检出，并且对于不同的基因型都能作出不同的溶解曲线变化图。Mohammad等[10]在基于高分辨溶解曲线分析技术的应用下，快速对β-地中海贫血基因突变人群进行位点筛查，结果显示此类快速筛查的方法与直接所得的基因类型结果完全一致。

2.2 扩增检测技术

2.2.1 突变扩增系统技术 在应用突变扩增系统技术的过程中，需要同时采用聚合酶链反应技术和琼脂糖凝胶电泳检测的方法，以观察检测对象中是否携带基因突变的扩增产物[11]。在现阶段突变扩增系统技术的应用中，一般仅需要进行单次的聚合酶链反应电泳便能呈现出正常的检测结果，同时具有成本低、方法简单便捷、检测时间段等优点，但其局限性在于无法一次性检测多突变位点，具有方法单一、样本容量小等缺陷。在Feng等[12]的研究中，采用突变扩增系统技术检测常见的地中海贫血突变位点，结果显示，该方法能够一次性检测14种不同的突变位点情况，但是目前临床上仍是以反向点杂交技术为主要应用方法，突变扩增系统技术应用范围有限。

2.2.2 多重连接探针扩增技术 多重连接探针扩增技术出现于2002年后，起初是由荷兰的一名学者提出的，作为一种相对定量分析技术被应用于临床检测中。在多重连接探针扩增技术的应用过程中，可明显发现该方法具有灵敏度高、通量高等优点，在基因序列的定量分析中，可以巧妙地结合衔接、杂交以及聚合酶链反应，提高了检测的样本容量，可以应用于30个以上的核苷酸序列拷贝数转变的检测中[13-14]。Rasoul等[15]采用多重连接探针扩增技术结合跨越断裂点技术的检测方法，用于地中海贫血新的基因突变类型研究中，结果显示，发现1个新增的地贫突变类型，并将其称为-α21.9。由此可见，多重连接探针扩增技术具有特异性明显的特点，其良好的重复性功能可以用于检测已知、甚至是未知的确实或重复型基因突变中。

2.2.3 跨越断裂点技术 跨越断裂点技术是一种检测地中海贫血缺失型基因突变的方法，其机制和原理在于通过在缺失片段中建立引物，来了解受检者基因中是否出现缺失、扩增等情况[16]。在正常情况下，若是引物设计出现缺失片段时，引物之间通常会保持一定的距离，因此不会出现扩增出目的的片段；若是在出现缺失片段的状态下，引物之间的距离则会缩短，同时也能出现扩增出目的的片段。Chan等[17]采用跨越断裂点技术检测常见的α-地中海贫血基因，结果显示-α4.2、-（α）20.5、-αSEA等六种常见基因能够被正常检出，这充分说明跨越断裂点技术在地中海贫血的基因诊断中可以起到重要的作用。目前，Gap-PCR技术在应用过程中具有设备要求低、步骤简单等特点，但是其局限性在于未能检测点突变或者未知的缺失突变基因。

2.2.4 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR是一种以荧光化学物质进行聚合酶链式反应循环后产物总量的检测方法，始终发生在DNA的扩增反应过程中，其机制在于能够对地中海贫血基因样品中的DNA序列进行定量分析，以了解地中海贫血患者基因突变的发展进程。在聚合酶链式反应的扩增阶段内，荧光信号可以对其阶段的发展情况进行实时的检测，而在反应扩增期间，随着各类指数的变化影响，该模板内的CT值和起始拷贝数均存在明显的线性联系，而这也是决定定量的重要依据[18]。在地中海贫血基因突变的检测中，针对核酸拷贝数的检测，实时荧光定量PCR是敏感度最高的一种方法，在DNA基因表达的研究中也应用广泛。Danjou等[19]选取32例常规缺失型地中海贫血患者作为研究对象，采用实时荧光定量PCR对其进行基因检测，结果显示，32例样本中均缺失α-珠蛋白基因。由此可见，实时荧光定量PCR在检测未知缺失类型的α-地中海贫血中检出率较高，并且具有检测快速便捷的特点，但是在未来的技术研究中，仍需要加强传统基因检测的不足，改善其局限性，提高检出率。

2.3 杂交检测技术

2.3.1 Southern印迹杂交技术 在地贫基因检测中，Southern印迹杂交技术一直是缺失型α-地中海贫血诊断的金标准[20]。经临床检测发现，该技术具有稳定性强、检出率高、检测准确等优点，但与其他检测技术相比，也存在一定的缺点，如检测时间过长、操作复杂、需要加入放射同位素灯。因此，Southern印迹杂交技术在常规诊断中应用较少。

2.3.2 等位基因特异性核苷酸探针杂交技术 等位基因特异性核苷酸探针杂交技术是一种基于杂交理念下进行基因突变检测的技术，属于常规检测的一种。在检测过程中，采用等位基因特异性核苷酸探针杂交技术扩增目的基因的片段，以促进产物与探针的杂交，进而通过自显影来记录并观察地中海贫血基因检测的结果[21]。目前，等位基因特异性核苷酸探针杂交技术在应用过程中具有灵敏度高、准确率高等优点，但如若针对多个突变基因进行检测时，也会耗费较长的时间，因此也不是地中海贫血杂交检测技术的最优选择。

2.3.3 反向点杂交（RDB）技术 反向点杂交技术在1989年被Rigas等[22]提出，是一种用于检测点突变的新技术。与常规的杂交检测技术相比，固定靶DNA的方式被膜上固定探针所取代，其机制是通过将扩增靶序列与膜上固定探针进行杂交，让多种特异性的探针能过在首次杂交中筛查检测出DNA中的突变位点。这一技术的出现和应用，改善了ASO探针杂交技术等传统检测方法中1次检测只能检出1种基因突变的弊端，也体现出了该检测方法的多样性。有研究指出[23]，目前我国的地中海贫血检测技术中，基因检测检出率最高的就是反向点杂交技术，并且具有操作便捷、诊断迅速，准确率高等优点，但与此同时仍存在一些不足之处，如费用高、检测时间长、操作复杂、影响检测结果的因素较多等，也为该检测技术的推广应用带来了一定的阻力。梁汉彰[24]在针对β-地中海贫血基因携带者中采用反向点杂交结合聚合酶链式反应技术，结果显示，单一的反向点杂交技术假阴性率为17.56%，反向点杂交结合聚合酶链式反应技术的假阴性率为3.42%。由此可见，与单一的反向点杂交技术相比，PCR-PDB技术在检测中的敏感度、特异性、通量更高，同时在成本和检测时间方面也具有许多优势，甚至能够在同一时间内进行3～5个已知基因突变的检测，在未知突变基因检测中也能表现出一定的优势，甚至在质量控制方面也具有显著效果。

2.4 基因测序技术

基因测序技术是指对聚合酶链式反应技术的产物进行突变检测的一种方法，不仅可以通过检测来确定受检样本基因突变的部位，甚至还能够明确基因突变的性质，在临床地中海贫血基因检测中起到了重要的作用。在基因测序技术的实际检测应用中，该技术具有灵敏度高、通量高等特点，并且采用了新的基因鉴定方法，在突变检验中可以验证新方法的鉴定效果。Mohanty等[25]选用了基因测序技术结合多重连接探针扩增技术来检测86例疑似地中海贫血基因缺陷的血清样本，结果显示，在检测中能够明确α合并β的双重杂合缺陷基因，其中α基因型占97.1%，β基因型占62.8%，α合并β的双重杂合基因型占26.4%。这充分提示采用基因测序技术结合多重连接探针扩增技术能够弥补单次基因测序技术的不足，进一步提高地中海贫血基因缺陷检测的准确率。

3 结语

随着各类检测技术的进步和发展，地中海贫血的基因诊断技术在此类疾病的诊疗中起到了不可替代的作用。但是，在检测技术实际应用的过程中，存在操作复杂、费用高、检测时间长等不足，因此大部分地中海贫血患者未能体会到检测技术带来的效益。与此同时，在现阶段地中海贫血基因的筛查中，检测方法和指标尚未完全统一，临床在进行研究的过程中也缺乏大量的样本来进行数据的验证，从而导致基因检测中存在一定程度的假阳性率或假阴性率。因此，继续加强检测方法的研究，追求一种操作便捷、经济便利、检测准确的技术方法成为了讨论和研究的热点。总之，在地中海贫血的基因检测技术发展过程中，需要不断提高各类检测技术的质量，提出能够广泛推广的检测技术，旨在做好地中海贫血基因诊断的工作，同时还应加强新的基因突变位点序列的研究和分析，不断研究新的检测方法，对基因筛查、提高人口素质来说都具有积极的意义。