噬菌体裂解酶Cp51在重组乳酸菌中的表达及对A 型产气荚膜梭菌的抗菌活性

龙航宇，陶佳梦，姜亚杰，李晓斌，邹佳汝，翁亚彪，林瑞庆

(华南农业大学兽医学院/广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广东广州510642)

产气荚膜梭菌Clostridium perfringens又称魏氏梭菌，是一种革兰阳性的人兽共患病病原菌，按其所产生的4种毒素(α、β、ε 和ι)分为A、B、C、D和E型[1]，最近有研究根据其分泌的肠毒素(C.perfringensenterotoxin，CPE)和NetB毒素可再分出F和G 型[2]。普遍认为A 型产气荚膜梭菌主要引起家禽坏死性肠炎[3-4]，传统上对于该病的防治措施为使用抗生素。随着人们生活水平的提高，人们对食品安全也越发重视，无抗养殖已为大势所趋，在此背景下，产气荚膜梭菌病发病率有所提高，给养殖业带来巨大损失。

噬菌体裂解酶作为一种专一的杀菌物质，有望替代抗生素，控制细菌性疾病的发生。裂解酶是噬菌体于侵染细菌后期合成、作用于细菌细胞壁肽聚糖层的一种酶，其作用为破坏宿主细胞壁，释放子代噬菌体[5]。裂解酶可从外部直接作用于革兰阳性细菌的细胞壁，较噬菌体省去了侵染、复制等过程，更为高效。乳酸菌是一类能够利用碳水化合物产生乳酸的革兰阳性细菌的统称，自然界中已发现的乳酸菌可划分为23个属[6-7]，主要包括乳杆菌、乳球菌、明串珠菌、片球菌、链球菌及双歧杆菌等。其中，乳酸乳球菌Lactococcus lactis作为乳酸菌的模式菌，其完整基因组测序已经完成，对调控基因和操纵子方面的研究日趋完善，为乳酸菌基因工程改造和表达载体的构建奠定了基础。乳酸菌的乳链菌肽(N isin)诱导表达系统(N isin-con tro lled expression system，NICE)极具发展前景，不仅调控严格，诱导物Nisin 无毒害无残留且容易获得，作为饲用诱导物优势明显[8]。乳酸菌是人和动物肠道内正常菌群之一，能促进营养物质的合成、改善胃肠道功能、缓解糖尿病、增强免疫力，为公认的食品级微生物[9-10]。除了本身的益生作用，乳酸菌没有内毒素，表达的外源蛋白质不需要经过纯化可以直接连同菌体一起服用，而且乳酸菌可以在肠道中定植存活[11]，口服基因工程重组乳酸菌后，其表达的用于治疗或免疫作用的蛋白就可以源源不断在肠道中产生并起到相应的作用。

本试验以乳酸乳球菌NZ9000表达A 型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51[12]，并检测表达产物和重组菌的体外杀菌效果，为产气荚膜梭菌病的新型药物和临床应用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒A 型产气荚膜梭菌Cp2-4来自华南农业大学寄生虫实验室，大肠埃希菌Escherichia coliMC1061购自北京华越洋生物科技有限公司；乳酸乳球菌NZ9000、质粒NZ8148 购自德国Mobitec公司。

1.1.2 培养基、试剂和仪器M 17培养基(海博生物技术有限公司)；GM 17C培养基(M 17培养基中加入终质量浓度为0.5 g·mL−1的葡萄糖、10μg·mL−1的氯霉素)；GM 17MC 恢复培养基(含20mmol·L−1MgCl2，2mmol·L−1CaCl2的GM 17培养基)。

QuickCutNcoI内切酶、QuickCutHind III内切酶、T4 DNA 连接酶、DNA marker DL5000、凝胶回收试剂盒(日本TaKaRa 公司)；Page Ru ler Prestained Protein Ladder(Thermo公司)；质粒抽提试剂盒(广州东盛生物科技有限公司)；氯霉素(SIGM A 公司)；BCA 蛋白浓度测定试剂盒、抗His鼠单克隆抗体、HRP羊抗鼠IgG(北京全式金公司)；超敏ECL 化学发光试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；Nisin、TSC琼脂、咪唑(广州鼎国生物)；镍填料Ni SepharoseTM6 Fast Flow(美国GE 公司)；2mm 电击杯(美国BTX公司)。其他试剂为国产或进口分析纯。

1.2 方法

1.2.1 目的基因与载体构建 A 型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51DNA 序列从GeneBank(AGH27916.1)中查找，序列5′端前加入NcoI酶切位点、Usp45的信号肽碱基序列，3′端终止密码子前加入6×His标签，终止密码子后加入Hind III酶切位点。因引入了酶切位点NcoI，为不引起移码突变，在信号肽前补2个A 碱基，构成1 268 bp的DNA 序列，序列发送至北京六合华大基因科技有限公司，进行乳酸菌表达密码子偏好性优化后，合成全基因。合成基因重组于PUC57克隆载体上。提取PUC57-Cp51质粒以及乳酸菌表达载体PNZ8148经内切酶NcoI、Hind III双酶切，回收目的基因片段以及表达载体片段，二者加入T4 DNA 连接酶过夜连接，转化于化学感受态大肠埃希菌MC1061中，获得的阳性克隆载体PNZ8148-Cp51送北京六合华大基因科技有限公司测序。

1.2.2 电转化按照Holo 等[13]的方法制备NZ9000感受态细胞，加入质粒PNZ8148-Cp51，转移至2 mm电击杯中，调节好电转仪BTX Gem iniX2参数(电压1 800 V，200Ω，25μF)，电击约4.5ms后，加入1mL 冰预冷的GM 17MC恢复培养基，30℃静置2 h，取上述液体分10、100和900μL进行涂板(GM 17C固体培养基)厌氧培养2 d。挑取单菌落，于5mL的GM 17C液体培养基中过夜培养。获得含有目的基因的阳性乳酸菌L.lactisNZ9000/PNZ 8148-Cp51，阳性克隆测序确认。同样方法转化空载体PNZ8148作阴性对照，菌株为NZ9000/PNZ8148。

1.2.3L.lactisNZ9000/PNZ 8148-Cp51的蛋白表达将重组表达菌以1:100的体积比接种于GM 17C液体培养基，30℃条件下静置培养过夜；将过夜培养物以1:50的体积比接种于GM 17C液体培养基，继续培养约2.5 h 至细菌D600nm≈0.5；分为诱导组和对照组(不诱导)，诱导组加入Nisin 至终质量浓度为1 ng·mL−1，诱导6 h 后终止培养，4℃、12 000 r·m in−1离心10m in，分别得到菌体沉淀和培养液上清。菌体沉淀重悬于10 mmol·L−1咪唑溶液中，功率400 W，超声4 s，间隔6 s，超声次数200次，破碎后分离上清与沉淀，沉淀用PBS缓冲液重悬。破碎上清液与沉淀各取50μL，加入10μL 6×Protein loading buffer。培养液上清用脱氧胆酸盐三氯乙酸(DOCTCA)沉淀法进行检测；取1mL培养液上清，加入10μL 2 g·mL−1的脱氧胆酸钠溶液和150μL 100 g·mL−1的三氯乙酸溶液，4℃条件下静置30 m in后，12 000 r·m in−1离心15m in，加入1 mL预冷的丙酮洗涤沉淀2次，将沉淀溶解于50 μL 50mmol·L−1的NaOH溶液中，加入10μL的6×Protein loading buffer。各处理样品同时作空载对照。将上述处理好的破碎上清液、破碎沉淀、培养液上清样品进行SDS-PAGE电泳。

1.2.4 重组蛋白纯化用“1.2.3”诱导组的培养方法处理5 L菌液，用GE 公司的纯化柱及镍填料纯化目的蛋白，选择不同浓度的咪唑溶液(20～200mmol·L−1)梯度洗脱，纯化后的蛋白进行SDSPAGE 分析，确定洗脱液的最佳咪唑溶液浓度。并用BCA 法测定蛋白浓度。选择最佳浓度进行，用透析袋进行浓缩，以便后续进行效果测试。

1.2.5 重组蛋白的Western Blot 检测将“1.2.3”

和“1.2.4”中的SDS-PAGE电泳后的蛋白胶，切成5 cm×5 cm 大小，超厚转印滤纸以及硝酸纤维素膜先用膜转移缓冲液浸泡湿润，在伯乐半干转印槽上依次从下而上放置超厚转印滤纸、硝酸纤维素膜、蛋白胶、超厚转印滤纸，去除气泡后，盖好接通电源，15 V 电压下电泳15m in。转印后，小心夹出硝酸纤维素膜，于装有质量浓度为5 g·mL−1脱脂奶粉的培养皿上封闭1 h，按体积比1:2 000加入小鼠抗H is抗体，4℃条件下孵育过夜，TBST洗膜3次，按体积比1:5 000加入羊抗小鼠HRP-IgG 抗体，室温摇床孵育1 h。TBST洗膜3次，将超敏ECL化学发光试剂的A、B发光液按照1:1的体积比混合，发光显色，拍照保存。

1.2.6 裂解酶杀菌效果测定为验证乳酸菌表达产物的杀菌效果，选取产气荚膜梭菌Cp2-4作为测试对象，用比浊法，按文献[12]的方法测定Cp51裂解酶的杀菌效果，并设置阴性对照。

1.2.7 重组乳酸菌NZ9000/PNZ8148-Cp51体外抑菌试验取出27支灭菌试管，各加入10mL LB液体培养基，27支试管分为A、B、C共3组，每组9支，依次编号A 1～A9、B1～B9、C1～C9。将预先制备好的重组乳酸菌NZ9000/PNZ8148-Cp51和空载乳酸菌NZ9000/PNZ8148的细菌数调节为1.4×107CFU·mL−1，A 组所有试管中加入100μL重组乳酸菌，B组中加入100μL 空载乳酸菌。取预先制备好的产气荚膜梭菌Cp2-4，加入生理盐水调节细菌数为1.4×107CFU·mL−1，迅速往所有试管中添加100 μL Cp2-4，A 1、B1和C1直接倍比稀释后涂板，记为0 h，往后，分别在6、12、24、36、48、60、72和84 h取1 支试管，10 倍倍比稀释，稀释至108倍，取100 μL涂TSC−卵黄平板，每个稀释度作3个重复，厌氧培养，对产气荚膜梭菌进行细菌计数。

1.2.8 数据处理利用Microsoft Excel2016进行数据处理，用GraphPad Prism 7进行绘图。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌表达载体构建与鉴定

构建的质粒电转化乳酸菌后，获得阳性克隆菌，提取重组乳酸菌质粒，质粒经内切酶NcoI 和Hind III双酶切后，得到2个条带(图1)，载体大小为3 100 bp，目的基因Cp51为1 268 bp，经测序，确定序列正确。

2.2 蛋白表达结果

重组菌NZ9000/PNZ8148-Cp51经Nisin 诱导后，上清和沉淀分别与空载相比较，均未见明显目的条带，可能是乳酸菌表达量较低，以致肉眼看不到目的条带，有待纯化以及Western Blot 的进一步验证。

图1 重组质粒PNZ 8148-Cp51的酶切鉴定Fig.1 Identification of recombinant p lasm id PNZ 8148-Cp51 by enzyme digestion

2.3 重组蛋白纯化结果

重组菌经大量培养，破碎后，上清纯化，经5次洗涤后，用高浓度咪唑溶液洗脱，试验结果表明，150 mmol·L−1的咪唑溶液能大量洗脱目的蛋白(图2)，经BCA 试剂盒测定，蛋白质量浓度为124μg·mL−1。

图2 NZ9000/PNZ8148-Cp51蛋白纯化SDS-PAGE电泳图Fig.2 SDS-PAGE analysis of purified NZ9000/PNZ8148-Cp51 protein

2.4 Western Blot 检测结果

Western Blot 检测结果显示，NZ9000/PNZ8148-Cp51菌经诱导后，培养液上清中有目的蛋白存在；不诱导的菌体中也有微弱表达(图3a)，NZ9000/PNZ8148-Cp51菌诱导后，破碎上清以及沉淀均有目的蛋白存在(图3b)。

图3 NZ9000/PNZ8148-cp51 Western Blot 检测结果Fig.3 Detection of NZ9000/PNZ8148-Cp51 by W estern Blot

2.5 裂解酶裂菌效果

裂解酶对产气荚膜梭菌抗菌效果见图4，从图4中可以看出质量浓度为1μg·mL−1以上的重组乳酸菌NZ9000/PNZ8148-Cp51表达的噬菌体裂解酶均对A 型产气荚膜梭菌有高效抗菌活性。

2.6 重组乳酸菌NZ9000/PNZ8148-Cp51体外抑菌结果

产气荚膜梭菌与乳酸菌混合培养后，比较活菌数对数值，发现乳酸菌使产气荚膜梭菌活菌数从9×109CFU·mL−1下降到约9×108CFU·mL−1。培养早期重组乳酸菌相比空载乳酸菌发挥了更强的抑制效果，但随着时间推移，24 h 后重组乳酸菌与空载乳酸菌之间的差异不明显(图5)。

图4 不同浓度NZ9000/PNZ8148-Cp51噬菌体裂解酶对A 型产气荚膜梭菌的抗菌活性Fig.4 Antibacterial activities of different concentrations of NZ9000/PNZ8148-Cp51 phagelys in against Clostridium perfringens type A

图5 产气荚膜梭菌Cp2-4单独培养及混合培养生长曲线Fig.5 Growth curves of Clostridium perfringens Cp2-4 in pure and mixed cultures

3 讨论与结论

不同于抗生素的杀菌机制，噬菌体裂解酶具有高特异性、对人类和动物无毒副作用以及不会产生药物残留等优势，因此有广阔的应用前景[14]。目前，多种细菌的噬菌体裂解酶可通过大肠埃希菌表达系统获取[15-16]，尽管大肠埃希菌表达系统成本低、产量高，但其以异丙基β−D−硫代半乳糖苷(Isopropylbeta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)等有毒物质进行诱导，需经过复杂的分离纯化，且蛋白进入消化道即可被降解，存在时间短，在动物体内难以起到有效杀菌作用。与之相比，采用乳酸菌表达系统，可免除复杂繁琐的提纯步骤，且乳酸菌为非致病性微生物，若作为蛋白药物的投递载体，其益生效果可以得到加强。利用乳酸菌表达活性酶有广泛的应用，Liang 等[17]将纳豆激酶的基因转入乳球菌中成功表达，产生的重组蛋白对纤维蛋白的溶解活性达到41.7 U·mL−1，可用于控制和预防血栓；Han 等[18]用乳酸菌表达超氧化物歧化酶，对炎症性肠道疾病有治疗作用。Martin 等[19]构建的重组表达IL-10的乳球菌MG1363，灌胃给小鼠后，能降低肠道通透性，促进免疫激活。重组的乳酸菌可以用来表达不同类型的蛋白，比如各种酶、抗原、细胞因子[20-21]，用乳酸菌重组表达裂解酶，对于防治细菌疾病的前景广阔。

相比大肠埃希菌表达，乳酸菌表达有诸多优势，在本研究中，利用乳酸菌与噬菌体裂解酶的双重抑菌和杀菌优势，通过构建重组乳酸菌NZ9000/PNZ8148-Cp51表达噬菌体裂解酶并对产气荚膜梭菌进行杀灭效果试验，蛋白电泳结果显示表达量较低，Western Blot 检测结果则表明，诱导后重组菌培养液中能检测到可溶性目的蛋白，且在不添加诱导剂条件下，也检测到菌体的微量表达产物。体外杀菌效果测定结果显示，构建的重组乳酸菌表达的裂解酶产物有强杀菌活性；体外菌液共培养试验表明，重组菌对A 型产气荚膜梭菌有一定的抑菌效果，乳酸菌和噬菌体裂解酶能起到加成的抑菌作用。国内外研究表明，噬菌体裂解酶具有极大的医用潜力，开发噬菌体裂解酶产品对革兰阳性病原菌有广阔的应用前景[22]。本研究成功构建A 型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶重组乳酸菌，为将来新型抗菌药的实际应用奠定了基础。