射干中异黄酮提取工艺的研究

刘晶 刘伟

为鸢尾科植物射干Belamcandachinensis（L.）DC. 的干燥根茎。射干味苦、性寒，是经常使用的中药之一。其中鸢尾苷、野鸢尾苷等异黄酮是射干中的主要活性成分。射干中的异黄酮类化合物具有抗炎、抗肿瘤、杀菌消毒、清除自由基等作用，因而建立最优的提取方法最大限度的将射干中的异黄酮类化合物提取出来是具有重要意义的。可以应用高效液相色谱法（HPLC）对射干中的两种异黄酮进行研究并测定其含量，因此本实验采用HPLC法从更换实验变量方面对射干中有效成分异黄酮的提取进行探索，从而得到最佳的提取条件。

一、实验部分

1、仪器

高效液相色谱仪（Agilent1100， Agilent Technologies， Germany），G1315B二极管阵列检测器，G1311A四元泵，G1312A在线真空脱气机，Rheodyne7225i定量进样阀，安捷伦色谱工作站。

RE-3000旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）;WK-1000A高速药物粉碎机（青州市精诚机械有限公司）;SK3300LH超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）。

2、 试剂与药材

样品提取所用的试剂（甲醇、乙醇、乙酸乙酯）为分析纯试剂（烟台市双双化工有限公司）;分析型液相检测所用甲醇试剂为色谱纯（Tedia company， INC， USA），所用的水是娃哈哈纯净水;实验用水是自蒸的一次水。射干药材购于聊城利民大药店。

3、色谱条件

色谱柱：Spherigel C18柱（200 mm×4.6 mm I.D.， 5 μm）;流动相：乙腈-水（19：81， v/v）;流速：1.0 mL/min;检测波长：266 nm;柱温：室温;进样量：20 μL。

二、 射干异黄酮提取工艺流程

等质量的射干粉末，分别加入等体积的试剂（如甲醇，乙醇，重蒸水等），采用不同的提取方法进行提取（超声、冷浸、回流），比较其中一个变量因素时，其它各条件均保持一致。提取液依次经过滤、浓缩、定容后，利用高效液相色谱仪测定鸢尾苷、野鸢尾苷等异黄酮的提取率。

三、 结果与讨论

1、 高效液相色谱条件的优化

本实验在应用高效液相色谱仪分析射干粗提物时，先后尝试了不同比例的甲醇-水（如40：60、36：44等）、乙腈-水（16：84、19：81、22：78等）作为流动相，实验结果表明当采用甲醇-水体系作为流动相时，由于热力学和可压缩性因素的影响，各色谱峰峰形变宽，且保留时间较长;由于乙腈洗脱能力和溶解能力都较强，当选择乙睛-水=19：81作为流动相，检测波长为266 nm，流速为1.0 mL/min时，射干中异黄酮类化合物基本实现基线分离。

2、 不同提取方法对射干异黄酮提取率的影响

为考察不同提取方法对于射干异黄酮提取效率的影响，使用70%乙醇作为提取溶剂，分别采用冷浸提取24 h、超声提取30 min、加热回流提取1 h。提取液经0.45μm滤膜过滤后，经HPLC检测。可以发现，相同的提取溶剂和时间，不同的提取方法对提取效率有显著的影响。由峰面积的大小可以确定加热回流时2种异黄酮的提取效率最高，冷浸的提取效率次之，超声的提取效率最低，所以最佳的提取方法是回流。

3、不同提取溶剂对射干中异黄酮提取率的影响

为选择合适的提取溶剂，考察不同提取溶剂对射干中异黄酮提取效率的影响。分别加入无水乙醇、水、无水甲醇作为提取溶剂，加热回流提取1.0 h，提取液经0.45μm滤膜过滤后，经HPLC检测。可以发现，相同的提取时间和方法，不同的提取溶剂对提取效率也有影响。由峰面积的大小可以确定提取射干中化学成分的最佳溶剂为无水甲醇，其次为乙醇，再次为水。但是因为甲醇有毒，所以采用乙醇效果更好些。

4、不同浓度提取溶剂对射干中异黄酮提取率的影响

为了选择合适的乙醇提取浓度，考察不同浓度的乙醇对射干中异黄酮提取效率的影响。分别采用无水乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇为溶剂加热回流提取1.0 h，提取液经0.45μm滤膜过滤后，用HPLC进行分析。不难发现，相同的提取方法、提取时间和提取溶剂，不同浓度的提取溶剂对提取效率也有影响。根据峰面积的大小可以确定提取射干中异黄酮的最佳乙醇浓度为70%。

5、不同提取时间对射干中异黄酮提取率的影响

为考察提取时间对射干异黄酮提取率的影响，使用70%乙醇作为提取溶剂，分别加热回流0.5 h、1 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h，提取液经0.45μm滤膜过滤后，经HPLC检测。根据峰面积的大小发现，当提取时间为1.0 h和1.5 h时，射干中异黄酮提取率最大，此后随着时间的延长，异黄酮提取率反而有下降的趋势。从节约时间的角度考虑，选择每次1 h作为最佳的提取时间。

6、不同提取次数对射干中异黄酮提取率的影响

为考察提取次数对提取率的影响，使用70%乙醇作为提取溶剂，分别将加热回流提取，每次1.0 h，提取液经0.45μm滤膜过滤后，经HPLC检测。检测后发现，相同的提取方法、提取时间和提取溶剂，随着回流次数的不同，提取的效率有很大的差异。通过峰面积的大小可知，第一次提取時即可提出大部分的异黄酮，第二次与第三次的提取量相当，但远远小于第一次，从节约性的角度考虑，因此加热回流提取两次即可。

综上所述，本实验通过考察影响射干中异黄酮提取率的提取方法、提取溶剂、不同浓度的提取溶剂、不同提取时间、不同提取次数，确定了射干中异黄酮的最优提取工艺：70%的乙醇作为提取溶剂，加热回流提取2次，每次的提取时间为1 h。

（作者单位：252000 山东省聊城市农药检定所;252000 山东省聊城水务水质检测有限公司）