微生物发酵对鲜姜汁抗氧化活性的影响

杨雷鹏 郭京波

摘 要：以鲜姜汁为原料，经酵母W.anomalus J12-7发酵，研究其对生姜抗氧化活性的影响。以单因素实验为基础，选择姜汁添加量、发酵温度和发酵时间为自变量，以抗氧化活性的响应值，采用Box-Behnken Design响应面优化发酵工艺，确立最佳发酵条件。结果表明，在20mLPDA液体培养基中添加381μL鲜姜汁，接种1%种子液，28.7℃温度下培养60h，发酵后姜汁总抗氧化活性较发酵前提高约63.67%。据此，为开发高附加值鲜姜产品提供新思路。

关键词：鲜姜汁;发酵;抗氧化活性;响应面分析

中图分类号：TB     文献标识码：A      doi：10.19311/j.cnki.1672-3198.2020.04.093

生姜，是姜属植物姜（Zinggiber Ofcinale Rosc）的根茎。在日常生活中，主要作为一种常见的香辛料被广泛使用。生姜中含有多种生物化学成分，包括挥发性的姜精油以及具有刺激性气味的姜酚、姜辣素、姜酮等，具有抗氧化、清除人体内自由基，降血糖、降低胆固醇、抗炎、抑菌、抗肿瘤、抗过敏等功效。鲜姜汁是无硫鲜姜去皮洗净后，研磨过滤而得到的金黃色半透明液体，有浓郁姜香味，充分保留生姜中的活性物质和独特气味，是天然的食品添加剂和防腐剂。但是由于鲜姜汁自身特有的姜辣味，加上鲜姜汁中高生物活性成分相对较少，难以富集和提取，限制了鲜姜汁的市场应用。目前，国内外对于生姜的研究，主要集中在提高生姜中高生物活性成分含量等的方面，通过一系列物理、化学等的实验步骤，将生姜中低生物活性成分的物质（如姜酚）转化为高生物活性物质（如姜烯酚），转化效率较低，且成本高昂，而通过微生物发酵的方式提高生姜生物活性的相关研究目前仍处在起步阶段，对于其研究相对较少。

酵母菌是传统发酵工业的优良菌种之一，可以利用不同原料，在不同发酵条件下通过自身代谢合成人们生产生活所需的各种产物，如酒精、L-乳酸、α-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶等，以及一些具有特殊功能的次生代谢产物，如异低聚麦芽糖等。近些年来，随着人们对于微生物研究的持续深入，酵母菌作为工程菌，有望在未来在不断拓展到化工、环保等其他领域。

本实验以鲜姜汁为底物进行酵母发酵，通过单因素及响应面优化试验，以酵母发酵鲜姜汁总抗氧化活性为指标，分析酵母发酵对于鲜姜汁抗氧化活性的影响，为高抗氧化活性鲜姜汁的市场开发以及天然生姜资源的利用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

酵母菌株：W.anomalus J7-2，山西师范大学生物工程实验室保藏;无硫生姜：购于临汾市尧都区尧丰市场。

试剂：PDA培养基、琼脂粉，北京奥博星生物技术有限责任公司;DPPH，ABTS，TPTZ、水溶性维生素E，北京伊诺凯科技有限公司;甲醇，冰醋酸，水合乙酸钠，过硫酸钾，天津市科密欧化学试剂有限公司;FeCl3·6H2O，天津市致远化学试剂有限公司。（以上所有试剂，无特别说明外，均为分析纯）。

实验设备：电子天平，上海精科;LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂;SW-CJ-2FD型超净工作台，上海博讯;HPX-9272 MBE型数显电热培养箱，上海一恒;5804R型高速冷冻离心机，德国基因有限公司;HH-6型数显恒温水浴锅，江苏金坛荣华仪器制造有限公司;752N型紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鲜姜汁制备

取适量无硫鲜姜，去皮洗净，晾干后切成小块，混入少量石英砂，用研钵研磨成汁，400目纱布过滤后即得到生姜原液。将生姜原液与水按照1∶4比例进行稀释，搅拌混匀后，将鲜姜汁置于冰箱中，4℃冷藏，备用。

1.2.2 酵母菌种活化及种子液制备

取上述W.anomalus J7-2酵母菌株，将其接种于PDA液体培养基中，28℃恒温培养48h，将新活化的酵母菌株恒温培养至生长对数期，控制OD600吸光值约为0.8±0.01。

1.2.3 发酵预处理

在20mL的PDA液体培养基中，接种1%酵母菌种子液，添加不同量的鲜姜汁（1：4）作为发酵底物，28℃恒温培养48h，将发酵液移入离心管中，残渣用2mL蒸馏水洗涤后移入离心管，6000r/min离心20min后取出，用医用注射器吸取上清液各2mL，用蒸馏水定容至10mL，进行相关指标检测;以PDA液体培养基中添加与实验组相对应的鲜姜汁量作为空白对照。

1.2.4 酵母发酵鲜姜汁的单因素试验

在20mLPDA中添加适量鲜姜汁，接入1%酵母种子液，选择姜汁添加量、发酵温度、发酵时间进行单因素试验。采用控制变量法，固定发酵温度为30℃、发酵时间为60h，向培养基分别添加不同量鲜姜汁，与酵母共发酵后测定总抗氧化活性（Total Antioxidant Capacity， TAC）;固定鲜姜汁添加量为360μL，发酵时间为60h，测定培养基分别在不同温度梯度下发酵后的总抗氧化活性;固定姜汁添加量360μL，发酵温度确定为30℃，测定培养基在不同培养时间下的总抗氧化活性。

1.2.5 酵母发酵鲜姜汁的响应面分析

以单因素试验为基础，选择姜汁添加量、发酵温度、发酵时间三者为自变量，发酵后姜汁的总抗氧化活性为响应值，使用Design-Export10.0软件中Box-Behnken Design进行响应面优化方案设计，利用方差分析（ANOVA）进行实验数据的模型拟合，根据实验结果计算最高抗氧化活性及对应相关因素的最佳水平。

1.2.6 酵母发酵鲜姜汁的抗氧化活性评价

实验通过测定发酵后培养液的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力以及Fe3+还原能力（FRAP），计算总抗氧化活性（TAC），单位为μmol TE/g Ginger juice。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 姜汁添加量对抗氧化活性的影响

在20mLPDA液体培养基中分别添加200μL、220μL、240μL、260μL、280μL、300μL、320μL、340μL、360μL、380μL、400μL鲜姜汁，接种1%种子液，28℃下发酵48h后测定总抗氧化活性。结果表明，在220-300μL姜汁添加量范围内，随着姜汁添加量的增加，总抗氧化活性无明显变化;在320-360μL范围内总抗氧化活性随着姜汁添加量的增加而增加，在添加量为360μL时达到最大值，为3340.95±169.05μmol TE /g Ginger juice;当添加量大于360μL时，总抗氧化活性开始下降，可能是由于姜汁添加量过多，酵母生长受到抑制，从而抗氧化活性降低。因此选择360μL姜汁添加量进行后续实验。

2.1.2 发酵温度对抗氧化活性的影响

在20mLPDA液体培养基中添加360μL鲜姜汁，接种1%种子液，分别置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃温度下培养48h后测定总抗氧化活性。测试结果表明，随着温度的升高，姜汁的抗氧化活性逐渐增强;当培养温度为30℃时，姜汁抗氧化活性最强，达到4759.72±237.99μmol TE /g Ginger juice;当温度高于30℃后，姜汁抗氧化活性明显下降，说明该温度下酵母代谢受到抑制，导致总抗氧化活性下降。因此选择30℃作为发酵温度进行后续实验。

2.1.3 发酵时间对抗氧化活性的影响

在20mLPDA液体培养基中添加360μL鲜姜汁，接种1%种子液， 30℃温度下分别培养12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h后测定总抗氧化活性。结果表明，在姜汁添加量为360μL，30℃培养时，随着发酵时间的增加，姜汁总抗氧化活性不断增加;当发酵时间为60h时，姜汁总抗氧化活性最高，達到3530.52±176.53μmol TE /g Ginger juice;当发酵时间超过60h后，总抗氧化活性变化不大，原因可能是由于酵母在发酵到60h之后，酵母总体生长平缓，并开始进行酒精发酵。因此，选择发酵时间为60h进行后续实验。

2.2 W.anomalus J12-7发酵鲜姜汁响应面分析

根据单因素实验结果，选择姜汁添加量（X1）、发酵温度（X2）、发酵时间（X3），利用Box-Behnken Design进行三水平三因素的响应面优化方案设计，即将上述17组实验的抗氧化活性测定结果输入到Design-Export软件中，进行回归方程模型的建立，经过分析后认为，该实验的回归方程模型为：TAC=4004.95+110.61X1-99.94X2+63.84X3+68.81X1X2+106.24X1X3-40.97X1X3-1111.40X12-371.63X22-136.80X32。该回归方程表示过W.anomalus J12-7发酵后，鲜姜汁总氧化活性（TAC）与三个自变量之间所存在的函数关系。

对该优化试验方案进行方差分析后认为，该优化实验设计模型的回归效应极显著（P<0.01），回归方程置信度高达99.9%;失拟项不显著（P=0.0751>0.05），表明模型拟合程度较好;复相关系数R2=0.9895，表明实验数据与该模型符合程度较高;AdjR2=0.9760，表明模型可以用来对实验结果进行准确预测。

根据模型所给出的理论最优组进行实验，将优化后测得的结果与优化前所测抗氧化活性最高组进行比较，得出W.anomalus J12-7发酵鲜姜汁的最优工艺参数为：姜汁添加量381μL、发酵温度28.7℃、发酵时间为60h，总抗氧化活性为4324.27±216.21μmol TE /g Ginger juice。

3 结论

本文主要通过W.anomalus J12-7酵母菌发酵鲜姜汁，测定发酵后姜汁的抗氧化活性;通过单因素试验及响应面优化确定W.anomalus J12-7的最佳发酵条件为：20mLPDA液体培养基中添加381μL鲜姜汁，接种1%种子液，28.7℃温度下培养60h，发酵后的姜汁总抗氧化活性较发酵前提高约63.67%。结果表明，W.anomalus J12-7可以有效提升鲜姜汁的抗氧化活性，改善发酵风味，在食品工业中，可用于生产具有高抗氧化活性的生姜保健黄酒及其一系列高附加值产品。

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