CRISPR/Cas系统在活细胞染色体成像中的应用

袁 曦 陈 群 何 倩 于冬梅 秦培武

摘    要：CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Proteins）是細菌抵抗外来入侵的一种自适应免疫机制，利用CRISPR/Cas9系统可实现双链DNA的剪切并诱导宿主细胞DNA修复机制，从而达到靶向编辑基因的目的。核酸酶失活的Cas9（Nuclease-deactivated Cas9，dCas9）耦联效应分子可以调控靶标结合位点附近基因的表达、表观遗传修饰及特异染色体区域标记。目前已开发出多种CRISPR/Cas9系统，可对活细胞中重复或低重复序列基因位点进行实时多位点同步成像，广泛应用于动物和植物细胞中。基于CRISPR/Cas系统的活细胞染色体成像技术为研究活细胞染色体动力学和三维染色体结构提供了全新角度。本研究针对CRISPR/Cas系统的生源机制及其在活细胞成像的应用和发展现状进行概述，以期为该领域的相关研究提供参考。

关键词：CRISPR/Cas系统;活细胞;染色体;成像

中图分类号：Q789         文献标识码：A           DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.01.002

Application of CRISPR/Cas9 System in Living Cell Imaging

YUAN Xi， CHEN Qun， HE Qian， YU Dongmei， QIN Peiwu

（Center of Precision Medicine and Healthcare， Tsinghua-Berkeley Shenzhen Institute， Shenzhen， Guangdong 510855， China）

Abstract： CRISPR/Cas is a bacterial adaptive immune system. By cleaving specific strands of DNA and inducing DNA repair mechanism in host cells through CRISPR/Cas9 system， genome editing can be achieved. Nuclease-deactivated Cas9 （dCas9） can regulate gene expression， epigenetic modification， and label specific chromosomal regions via coupling effectors. Diverse CRISPR/Cas9 systems can target either the repetitive or low repetitive chromosome loci for live cell visualization， which is applicable to both animal and plant cells. Live cell chromosome imaging based on CRISPR/Cas system provides a new perspective for studying chromosome dynamics and three-dimensional genome structure. This review summarized the recent progress on the study of the molecular mechanism of CRISPR/Cas system and its application in living cell imaging.

Key words： CRISPR/Cas system; living cell; chromatin; imaging

1 CRISPR/Cas技术的作用原理

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是自然界中细菌抵御病毒侵染而进化产生的一种天然免疫系统，自2012年起被广泛应用于基因编辑研究中[1]。CRISPR/Cas（CRISPR-associated Proteins）系统在微生物中具备丰富的遗传多样性，已经发现的CRISPR/Cas系统可分为两大类，包括6种主要类型和33种亚型 [2]。每种CRISPR-Cas系统的组成结构各具特点，当前应用最广泛的是化脓性链球菌Cas9（Streptococcus pyogenes Cas9）[3]。近年来，CRISPR/Cas系统在靶向基因编辑、基因激活和抑制、表观遗传修饰、全基因组筛选、RNA病毒检测和活细胞染色体成像等领域取得了一系列突破性进展[4-6]。

Cas9的免疫作用机制如图1所示：细菌初次被来自噬菌体或病毒的外源DNA侵染时，其CRISPR系统中的Cas1和Cas2酶识别并切割部分外源DNA中被称为间隔区（Spacer）的DNA片段，并将其整合插入细菌DNA的回文重复序列（Palindromic Repeats）之间，从而获取间隔区;当细菌再次被相同的外源病毒DNA侵染时，宿主DNA会转录pre-crRNA（precursor-CRISPR RNA），随后被切割成多个guide RNA（gRNA）。gRNA由crRNA（CRISPR RNA）和反式激活RNA（Trans-activating CRISPR RNA，TracrRNA）组成。crRNA中的spacer序列可与靶标DNA的一条链碱基互补配对，tracrRNA与crRNA的CRISPR重复区域（Repeats）碱基配对连接形成具有发卡结构的gRNA，从而把这2个RNA融合形成单链的sgRNA（single guide RNA，sgRNA）。gRNA与Cas9结合后，crRNA搜索入侵病毒基因组DNA中能够与其互补配对的位点;Cas9识别PAM（Protospacer-Adjacent Motif）位点并锚定相应区域，再通过Cas9核酸酶切割病毒DNA，从而实现阻碍病毒的入侵[7]。

CRISPR/Cas利用这种简单高效的识别系统，精准靶向某一特定DNA片段并进行切割，切割后的双链DNA在细胞内可以通过两种方式修复，一种是非同源末端连接修复途径（Non-Homologous End Joining Repair Pathway，NHEJ），NHEJ容易引起切割位点附近发生随机插入或者删除，从而破坏靶基因的正常表达;另外一种是同源定向修复途径（Homology Directed Repair Pathway，HDR），利用同源重组机制中可将目标DNA片段整合到宿主基因组中。相比之前的基因编辑工具，如锌指核酸酶（Zinc Finger Nuclease，ZFN）和转录激活因子样效应核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nuclease，TALEN），CRISPR/Cas9系统不需要进行繁杂的人工蛋白改造，只需设计相应的gRNA即可实现精准定位并切割靶标DNA，CRISPR/Cas基因组编辑系统的操作更加简单灵活、成本更低、特异性更高、识别范围更广[8]。

CRISPR核酸内切酶的相关研究一直在快速发展，从较小核酸内切酶到经过修饰的核酸内切酶，性质各样的核酸内切酶使CRISPR系统基因组编辑功能更加强大。CRISPR/Cas9编辑基因是永久性的，对一些应用而言并不理想。因此，研究者们对Cas9内切酶核心区域进行点突变，使dCas9（Nuclease-deactivated Cas9）丧失剪切DNA的内切酶活力，但仍保留dCas9靶向特定DNA序列的能力[9]。利用dCas9与转录调节因子融合，能够实现可逆地调节基因表达，在转录水平上激活或抑制非编码RNA（Non-coding RNA， ncRNA）、天然反义转录产物（Natural Antisense Transcript， NAT）或MicroRNA的表达。下面分别介绍dCas9在转录调控、表观遗传修饰、细胞染色体成像方面的应用概况。

2 CRISPR/dCas9在基因转录调控中的应用

CRISPR/dCas9可通过与转录激活因子或者抑制因子融合实现对靶向基因的表达调控，其中dCas9-SAM（dCas9-Synergistic Activation Mediator）系统通过募集转录激活因子来调节靶基因表达。如dCas9与转录调控因子（如VP64和p65）融合，通过sgRNA靶向内源启动子实现转录因子增强基因表达[10]。当dCas9与转录抑制因子KRAB（Krüppel Associated Box）融合时，募集组蛋白促进异染色质形成，可实现可逆抑制基因表达5～10倍。与依赖于细胞质中mRNA降解来进行基因抑制的RNA干扰机制不同，dCas9-KRAB能够在DNA水平上进行转录抑制，可用于ncRNAs、microRNAs、核定位RNA的转录抑制，扩展和提高了非mRNA研究手段[11]。

表观遗传修饰是一系列针对遗传物质的精准化学修饰，其可在不改变DNA序列的情况下导致特定基因选择性沉默或活化。DNA甲基化及组蛋白修饰（例如甲基化、乙酰化）调节特定基因组区域是否被解压缩且可被RNA聚合酶II接近，或者它是否被紧密地捆绑成转录沉默的异染色质。表观遗传修饰作为基因表达调控的第二级，是可遗传和可逆的。CRISPR/dCas9技术的出现为表观遗传学研究提供新的途径。将不同的效应物连接到dCas9系统上，可实现表观遗传修饰改变，如组蛋白乙酰转移酶p300与dCas9融合能够使特异靶DNA序列附近的组蛋白乙酰化，从而激活基因表达;而dCas9与去甲基化酶LSD1（Lysine-Specific Histone Demethylase 1A）融合能使靶序列附近的组蛋白去甲基化[12]。

3 CRISPR/dCas系统在活细胞染色体成像中的应用

Chen等[13]于2013年首次報道了使用dCas9进行染色体成像的相关研究，目前CRISPR/dCas系统已是活细胞染色体成像研究的一项重要工具。Web of Science数据库检索发现，2016—2017年该主题文献年出版数量快速增加，出版文献年引用频次也逐年递增。这表明，近年来利用CRISPR/dCas系统进行活细胞染色体成像逐渐得到了研究者们的密切

关注（图2）。

dCas9与eGFP（enhanced Green Fluorescent Protein，eGFP）融合表达后，dCas9-eGFP复合体与sgRNA在细胞内组装成有功能的复合体，待复合体结合到靶标DNA后，可通过荧光显微镜对活细胞中端粒等高重复染色体区域进行动态观察。在非重复基因座上靶向36～73个sgRNA，该系统能够观测到MUC4基因座内的非重复基因组区域。为实现多个gRNA的复用并将数十个不同的gRNAs高效递送到单细胞中，Gu等 [14]扩展了dCas9-eGFP成像方法，开发了一种称为嵌合gRNA寡核苷酸阵列（Chimeric Array of gRNA Oligonucleotides，CARGO）的技术。CARGO技术将几十个不同的gRNAs组成阵列递送到单细胞中，从而精确识别独特的非重复DNA片段，再利用多种荧光分子对其进行标记，实现了对特异DNA片段的动态观测。利用该技术，Gu等[14]定量地测定了胚胎干细胞中发生分化相关活性的增强子和启动子的运动变化情况。

由于dCas9蛋白倾向定位在核仁中，dCas9-eGFP方法在核仁中会引发较高的背景信号。为了增强荧光信号强度和提升信噪比，可用更多的荧光蛋白（Fluorescent Protein，FP）分子标记dCas9，例如通过使用超新星标记系统（Sun-Tag），即利用一般对照不可诱导4号（General Control Non-Inducible 4，GCN4）肽序列与特异纳米抗体之间相互作用募集多个FP[15]。利用dCas9-SunTag可以实现仅用20种不同的sgRNA就能连续跟踪MUC4基因的非重复区域[16- 17]。

上述方法是针对改造过的dCas9与荧光蛋白融合进行基因组成像，另外一种可替代方式是使用修饰的sgRNA对基因组位点进行成像。这些经修饰的sgRNA可以募集与FP融合的序列特异性RNA结合蛋白。例如经修饰、包含多个重复RNA适配体的sgRNA，这些适配体可以特异性结合其同源结合蛋白（Cognate Binding Protein，CBP）。最广泛使用的RNA适配体是MS2，一种源自噬菌体MS2的RNA茎环结构，其可以特异性结合MS2外壳蛋白（MS2 Coat Protein，MCP）。Qin等[18]的研究表明，基于MS2的系統可以用单个sgRNA对低重复序列位点进行成像，增加MS2片段的重复次数，可显著提高信噪比和灵敏度。使用4个序列特异sgRNA，每个含有16个MS2适体，对低重复序列区域进行标记后，使用晶格光片显微镜（Lattice Light Sheet Microscopy，LLSM）可实现对细胞周期中天然染色质基因座的跟踪，并确定差异转录活性和非活性区域在细胞核中的定位。上述研究结果表明，MS2修饰的sgRNA方法可有效地监测活细胞中重复和非重复基因组区域的位置和动态。

此外，将CRISPR-dCas9和Pumilio RNA结合蛋白相结合建立的Casilio系统，也可用于活细胞基因组位点的标记[19]。Pumilio和Fem3 mRNA结合因子（Fem3 mRNA-Binding Factor，FBF）蛋白共享保守的Pumilio/FBF（PUF）RNA结合结构域，该结构域可通过设计用以结合特定的8聚体RNA序列（PUF-binding site，PBS）。Cheng等[19]通过设计sgTelomere和sgCentromere，使其分别携带多个PUF结合位点，并将dCas9和Clover-PUF/sgCentromere-20×PBS及Ruby-PUF/sgTelomere-25×PBS在HEK293细胞内共表达，成功实现了在同一细胞内同时对染色体端粒和中心粒进行成像观察。

4 CASFISH及CRISPR/dCas9与DNA FISH结合在染色体成像中的应用

荧光原位杂交（Fluorescencein Situ Fybridization，

FISH）技术是利用与荧光基团耦合的核苷酸作为探针，在细胞内与相应的靶DNA或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜下观察荧光信号而对组织、细胞或染色体上DNA或RNA进行定性或定位分析的一种技术[20]（图3）。FISH迄今已发展了30多年，其在识别DNA和RNA序列方面具有高度敏感性和特异性，并且能在单细胞水平上同时对多个染色体位点进行可视化追踪[21]，因此在解决单个染色体或整个基因组的结构、突变和进化等有关方面得到了广泛应用[22]。但由于DNA FISH需要经过甲酰胺和热处理使DNA变性以便于与荧光核酸探针进行杂交，该过程可能会对生物体结构和基因组织的完整性造成破坏，无法准确的反映其原有空间结构[23]。CASFISH（Cas9-mediated FISH）利用CRISPR/Cas9复合物具有识别特异靶DNA的特性来标记序列特异性的染色体位点[24]，DNA不需要经过变性处理，有利于保留细胞形态和基因组结构。CASFISH既可对含有高重复序列的染色体位点进行标记，也可通过使用多个sgRNA将Cas9-荧光蛋白复合物靶向目标位点，从而标记非重复染色体位点。不同荧光标记的dCas9/sgRNA还可对细胞中的多个染色体位点进行同步多色标记，以便于研究多个染色体位点之间的空间关系。由于CASFISH是利用dCas9介导的酶促反应对特定序列进行标记，在优化条件下15 min内即可完成标记，相对DNA FISH方法更加快捷[24]。将dCas9与Halo标签融合，形成的dCas-Halo可用于各种荧光染料标记[24-25]，再利用靶向不同DNA序列的sgRNA组合，可增加荧光染料选用的灵活性和多样性，并降低开发靶向多重基因位点荧光探针的成本。

Takei等[26]和Guan等[27]提出了一种先跟踪后识别（Track First and Identify Later）的策略，即将CRISPR/dCas系统和DNA Sequential FISH（seqFISH）相结合的方法来对活细胞内的多个染色体位点进行动态追踪（图4）。首先用CRISPR/dCas9系统对多个染色体位点进行单色实时成像。当动态记录结束时再将细胞固定，连续多次使用DNA FISH来识别每个位点的身份。这一方法将染色体位点的动态追踪任务和这些位点的独特识别分离，将CRISPR标记和seqFISH两者优势相结合，实现了在单一颜色通道下对活细胞的多个染色体位点的动态追踪。为了能够在实时成像之后快速且连续的进行DNA FISH操作，Guan等[27]优化了FISH方法，使得整个染色过程能在1 min内完成，极大地缩短了试验周期。每轮成像检测后利用甲酰胺溶液洗涤以去除上一轮结合的DNA探针，避免连续多次FISH试验中DNA探针信号之间的干扰。利用该方法可同时对7个染色体位点进行鉴定，DNA FISH经过20多轮的染色和洗涤后，仍能保持高强度的荧光信号和高效率的清洗效果[27]。这种将实时和固定成像联合使用的方法同样可用于RNA-FISH中对多个靶标RNA成像。

5 CRISPR/dCas系统在细胞染色体成像中的双色标记

在活细胞中对染色体进行动态成像往往需要能够同时观测一个以上的基因位点，如研究表观遗传调控机制就涉及跟踪两个基因座染色质的相互作用。目前CRISPR/dCas9系统通过以下两种策略对活细胞中的基因组进行双色标记。

一种策略是将来自不同菌种的dCas9蛋白耦合不同荧光蛋白[28-29]（图5A）。由于源自不同菌种的Cas9识别特定的PAMs序列且sgRNA骨架不同，彼此互不干扰，因此可以对不同基因组位点进行多色标记。除了化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes，SP）Cas9之外，来自脑膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria meningitides，Nm）、嗜热链球菌（Streptococus thermophiles，St1）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，Sa）等的Cas9蛋白可以任意组合实现多色CRISPR成像。利用不同荧光染料标记的dCas9-sgRNA可以确定不同染色体上基因座之间的核内距离或同一染色体上两个基因座之间的空间距离[29]。与SPCas9相比，NmCas9和St1Cas9能识别更长的PAM序列，因此其靶向设计受到了一定限制。此外，荧光标记的dCas9蛋白体积较大，当将这些融合蛋白引入同一个真核细胞时，增加了转染和病毒感染的难度。

另外一种策略是通过修饰sgRNA以实现基因组位点双色成像（图5B）。将RNA发夹结构引入sgRNA的3'末端，使sgRNA转化为支架RNA（scaffold RNA，scRNA），当与dCas9共表达时，可以将与荧光蛋白融合的RNA结合蛋白募集到靶点以实现特异标记[30-32]。如Fu等[30]运用此方法在sgRNA的3'末端引入了MS2和PP7，生成的sgRNA-MS2 和sgRNA-PP7分别与MCP-EGFP和mCherry-PCP融合蛋白相结合，实现了以不同颜色同时标记主要和次要卫星区域以及同时标记小鼠染色体12上两个单独的基因位点。Shao等[32]的研究表明，此方法能够长期同步对端粒和着丝粒的高重复区域进行稳定成像，并且基于sgRNA的标记方法比基于Cas9的标记方法更加耐受光漂白，这对于染色体动态的、连续的和长期的跟踪更具优势。此外，Zalatan等[33]基序可用于BFP融合的com蛋白识别，因此通过设计含有com基序的scRNA，可实现以不同颜色标记第三个基因座。通过修饰sgRNA实现基因组位点双色成像的最大的优点在于，只使用一种dCas9蛋白即可实现染色体位点的多色标记。由于SPCas9的PAM位点（NGG，N代表任何碱基），广泛存在于基因组中，其靶向设计较NmCas9、St1Cas9等更具灵活性。与基于荧光蛋白修饰不同来源的Cas9的成像系统相比，修饰sgRNA进行多色标记更具灵活性，但此方法需要设计更多的融合蛋白，使得细胞系的构建过程更加复杂。

6 CRISPR/dCas系统在细胞成像中的多色标记技术

在染色体动力学的研究中，往往需要同时对多个染色体位点进行特异性和差异性标记，但上述方法最多只能同时追踪活细胞中的3个基因组位点，难以满足研究需要。为解决这一问题，Ma等[34]于2016年开发了一种名为CRISPRainbow的技术来实现对基因组多基因座进行标记，这是一种通过设计sgRNA以结合不同荧光蛋白对特定基因位点成像的技术（图6）。首先将发夹结构RNA（如MS2、PP7和boxB）连接到sgRNA的3'端或茎环上，这些特殊的发卡结构分别能被融合了不同荧光蛋白（BFP、RFP和GFP）的天然结合蛋白（如MCP、PCP和N22）所识别。因此，当sgRNA与两个相同的荧光蛋白组合时，会产生3种基色（蓝色、红色和绿色）;当sgRNA分别与两个不同的荧光蛋白组合时，3种基色两两叠加会产生青色（BFP+GFP）、品红色（RFP+BFP）和黄色（GFP+RFP）;而当sgRNA同时与3种荧光蛋白组合时，3种基色叠加将得到白色。双重双色标记是通过sgRNA结合不同的荧光蛋白来实现的。这一技术能够动态地对多个不同的染色体位点进行可视化观察，目前已实现在活细胞中同时对6个染色体基因座同时成像[34]。与基于荧光蛋白修饰Cas9进行多色标记相比，CRISPRainbow只需利用SPCas9结合融合了不同荧光蛋白的sgRNA，标记颜色的范围更容易拓展。理论上，再增加一种颜色，CRISPRainbow将能够同时对15个基因组位点进行特异性的标记。但由于在该系统中对sgRNA进行了大量修饰，导致sgRNA的稳定性不佳，而sgRNA的稳定性是影响标记效率的重要因素[35]。

为此，Ma等[36]提出了一种名为CRISPR sgRNA-Sirius的方法来改善CRISPR成像系统的标记效率和灵敏度。首先，他们利用CRISPR-Broccoli系统[37]在活细胞中研究了在不同位点插入外源RNA对sgRNA稳定性的影响，发现外源RNA插入sgRNA的tetraloop比3'-末端更稳定[36]。然后通过进一步优化RNA适体的结构，设计出了3种CRISPR-Sirius结构（sgRNA-Sirus-8XMS2、CRISPR sgRNA-Sirius-8XPP7和CRISPR sgRNA-Sirius-4X（MS2-PP7）。该结构在保持灵活多色标记的基础上，提高了在活细胞中追踪DNA的灵敏度，实现了同时可视化同一染色体上的多个不同基因座位，并测量了不同基因座的空间距离、观测了其动态行为。高效稳定的多色标记方法有望成为研究细胞周期进程、表观遗传调控期间或细胞刺激反应中染色体内和染色体间结构域动态相互作用的有力工具。

7 CRISPR/dCas系统在植物细胞成像中的应用

尽管CRISPR/dCas9系统于2013年就开始用于人体和哺乳动物细胞特定基因组位点的可视化研究[13]，但直到2017年Dreissig等[38]才首次将其应用于植物细胞成像研究。在2017年以前，CRISPR/Cas9系统在植物细胞中主要用于基因编辑和转录调控研究。Dreissig等[38]利用分别标记了eGFP和mRuby2的化脓性链球菌dCas9和金黄色葡萄球菌dCas9，观测本塞姆氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶细胞，开展蛋白质-端粒相互作用动力学研究，揭示了端粒在细胞间期的动态运动规律。通过在叶片细胞中共同表达Sp-dCas9-mRuby、sgRNA-端粒和结合了GFP的端粒重复结合蛋白1（Telomeric Repeat Binding Protein 1，TRB1），研究者们还探讨了染色体端粒的重复序列与TRB1结合比例之间的动态关系。基于CRISPR/dCas9系统的细胞成像技术有望发展成为研究植物细胞染色体动力学的重要技术。

8 展 望

尽管目前已开发出多种CRISPR/dCas9系统用于活细胞中重复或低重复序列基因组位点实时成像研究，但CRISPR/dCas9系统的靶向效率和成像灵敏度仍需进一步提高。CRISPR/dCas9系统的靶点主要受PAM序列的限制，若想实现更多基因组位点的同步精确成像，需进一步开发多样化的Cas9系统与PAM识别位点，从而进一步扩大CRISPR/dCas9系统的可识别靶点范围。例如，寻找具有特异PAM位点的Cas9，或通過基因工程手段有目的性的设计Cas9，开发拥有新PAM特异性的Cas9突变体。SpCas9的PAM序列在动植物基因组中广泛存在，但其基因长度大于4 kb，增加了转染和病毒感染的难度，研发小型的Cas9同源蛋白是发展其在细胞成像领域中应用的重要方向。此外，优化sgRNA的结构，设计更高效的sgRNA传递系统，有助于充分发挥该技术标记单拷贝基因的潜力。进一步提高CRISPR信号或使用高灵敏度的尖端显微镜，可进一步优化信噪比，也有利于进一步提高成像效率。高灵敏度和高效率的实时动态成像技术有望帮助解决诸多基因组和染色质领域研究的关键问题，CRISPR/dCas活细胞染色体成像技术的发展是解决这些问题的核心要义。

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收稿日期：2019-11-21

基金項目：国家自然科学基金（31970752）;Shenzhen Municipal Development and Reform Commission Subject Construction Project （[2017] 1434）;Shenzhen Municipal Development and Reform Commission， Shenzhen Engineering Laboratory for Precision Medicine and Healthcare（SDRC[2015] 1950）

作者简介：袁曦 （1995—），女，重庆人，硕士，主要从事细胞成像方面的研究。

通讯作者简介：秦培武（1979—），男，黑龙江人，助理教授，博士生导师，主要从事染色体结构与基因转录和细胞功能关系及荧光成像方法开发方面的研究工作。