抗富亮氨酸胶质瘤失活1蛋白相关癫痫的致病机制

邵洪雪，张忠玲

(哈尔滨医科大学附属第一医院神经内科，哈尔滨 150001)

富亮氨酸胶质瘤失活1蛋白(leucine-rich glioma inactivated 1，LGI1)是一种分子量为60 000的分泌蛋白，主要表达于齿状回。LGI1引起的癫痫发作与人类的遗传和自身免疫病因有关。LGI1基因突变可导致常染色体显性遗传颞叶外侧癫痫(autosomal dominant lateral temporal epilepsy，ADLTE)。ADLTE是一种罕见的以伴有听幻觉或视幻觉的部分癫痫发作为主要表现的遗传性癫痫综合征[1]。目前，在ADLTE家族中至少发现了43个LGI1基因突变，其中包括28个错义突变。大部分导致ADLTE的LGI1基因突变导致分泌缺陷。在成人中，LGI1与获得性自身免疫性边缘叶脑炎相关。癫痫是获得性自身免疫性边缘叶脑炎常见的临床表现，表现形式主要包括部分癫痫发作、肌阵挛和全身性强直阵挛发作[2]。面-臂肌张力障碍发作具有特异性的诊断意义[3]，实验室检查发现，患者的血清及脑脊液中的LGI1抗体滴度均升高，但抗体滴度的高低只与疾病的缓解、复发相关，而与疾病的严重程度无关，且免疫治疗效果良好[4]。目前认为LGI1抗体是具有致病性的，但其如何致病尚不清楚。中枢神经系统中的LGI1有多种功能与癫痫相关。因此，无论是LGI1抗体与LGI1可逆性的结合，还是LGI1基因突变均可导致LGI1及其相关结构的功能缺陷，从而导致癫痫发作。现就ADLTE及LGI1抗体相关脑炎引起癫痫的致病机制予以综述。

1 LGI1基因突变的致病性

ADLTE是一种常染色体显性遗传疾病，外显率较低，只有不到50%的ADLTE患者中发现LGI1基因突变[5]，这表明该综合征是遗传异质性的。LGI1基因突变的致病性可能涉及单倍性不足和显性负性机制。在LGI1基因敲除小鼠模型中，纯合子的基因敲除导致自发性癫痫发作和早亡，而杂合子的LGI1+/-小鼠表现为听觉刺激诱发癫痫发作的阈值降低[6]。癫痫表型在纯合子中较在杂合子中更为极端，这为单倍体不足的机制提供了证据。虽然在许多基因中，截断突变导致异常信使RNA的衰变[7]，但是目前的证据表明，LGI1中的截断突变不总是伴随这一过程，如在携带LGI1基因额外拷贝的转基因小鼠中，LGI1基因包含第6外显子中的截断突变，截断了C端癫痫相关的重复域(epitempin repeat，EPTP)，只表达N端亮氨酸富集区(leucine-rich repeat，LRR)，阻止了谷氨酸能突触的成熟，这表明突变的显性负效应[8]。然而，由于该转基因小鼠没有表现出任何自发的癫痫表型，因此该突变小鼠是否为可靠的ADLTE模型仍不清楚。此外，LGI1在人类中的基因突变是如何通过单倍性不足或显性负性的方式促进癫痫发生的问题仍需要解决。迄今为止，在LGI1的蛋白编码区域已检测到30多个ADLTE导致的突变，其中约30%的突变被预测为无义突变，约70%的突变被认为是错义突变，会影响蛋白质的功能[9]。研究发现，这些错义突变会使蛋白质的分泌减少或大大减少[10]。因此可以提出假想如果LGI1作用位点位于细胞膜外，那么携带这些特殊突变的等位基因可能是无功能的，即通过单倍体不足机制致病。如果LGI1结合蛋白在细胞膜内，那么可能是错义、截断突变,可能以竞争性结合受体的显性负性机制致病。

2 ADLTE的致病机制

2.1LGI1基因突变导致分泌蛋白缺陷 既往研究发现，大多数导致ADLTE的LGI1基因突变抑制LGI1蛋白的分泌，主要通过改变LGI1的折叠和(或)翻译后修饰引起蛋白功能丧失，从而导致癫痫表型[7]。LGI1由两个结构域组成，即高度保守的LRR结构域和EPTP结构域，其中EPTP结构域位于C端，包含7个抗原决定基重复片段，LRR结构域位于N端，包含3个富含亮氨酸的重复序列；LGI1的三维结构显示，LGI1蛋白的C端EPTP结构域由一个包含7个叶片的β-螺旋组成，每个叶片由四条反平行的β-折叠构成，N端与C端组装形成一个封闭的螺旋结构。通过二硫键和协调钙离子稳定EPTP β-螺旋结构[11]。在已报道的LGI1基因突变中，C42R、C42G、C46R、C46F、C179R和C200R的突变翻译到半胱氨酸残基上导致在LRR区域的N端和C端形成二硫键，干扰了正常的折叠[9]。C286R突变破坏了分子内与Cys260的二硫化，破坏了β-螺旋内部结构。E383A突变破坏β-螺旋结构内部的钙离子的结构[7]。P43R是Liu等[1]新发现的一个突变，位于N端帽，可以导致分泌缺陷。同时，他们还发现这种LGI1基因突变导致了皮质神经元迁移功能紊乱，这也解释了为什么LGI1相关的癫痫主要累及颞叶。LGI1基因突变引起错误转录与折叠的缺陷蛋白的分泌引起的功能缺陷，被认为是导致单倍体功能不足的主要机制。研究发现，这种单倍体不足不是由于缺乏蛋白质分泌，而是由于内质网蛋白质质量控制机制在细胞内降解错误折叠的突变蛋白质[12]。

2.2LGI1基因突变降低LGI1与ADAM22亲和性 长期以来，抑制蛋白分泌一直是LGI1基因突变导致蛋白质功能丧失的唯一机制。近年有文献报道了引起ADLTE的不抑制蛋白质分泌的LGI1基因突变机制[11，13-14]。研究发现，T380A、S473L、R474Q和R407C四个突变几乎不影响蛋白质折叠，而是选择性地改变与ADAM相互作用的位点，干扰LGI1与ADAM22相互作用[13]。ADAM22是公认的LGI1受体，其金属蛋白酶样结构域可以与LGI1的EPTP结构域结合形成LGI1-ADAM22复合物，ADAM22中的3个芳香残基(色氨酸398、酪氨酸408、酪氨酸409)进入LGI1 EPTP螺旋边缘的疏水囊，并以氢键相互连接形成LGI1-ADAM22复合物。LGI1-ADAM22复合物的晶体结构在二聚体-二聚体组装中显示为2∶2 的异四聚体结构；此外，LGI1-ADAM复合物还可以3∶3的异型六聚体结构存在[9]。通过一个LGI1分子的LRR结构域与另一个LGI1分子的EPTP结构域相互作用，可以连接两个相距遥远的ADAM22分子。这种结构特征支持了由ADAM22-LGI1-ADAM22的跨突触复合物介导的跨突触连接的观点。在已报道的突变中，E123K和R474Q两个人类ADLTE突变作用于LGI1-ADAM22复合物的2∶2装配(也可能是3∶3装配)中LGI1-LGI1相互作用的界面[15]。S473L突变减少了LGI1与ADAM22的结合[7，16]。R407C突变在三维蛋白质模型上的定位显示，这种突变不会引起大的结构重排，但可能破坏LGI1与靶蛋白的相互作用[17]。Ho等[18]将22个报道的LGI1错义突变分为分泌缺陷突变和分泌正常突变，建立并分析了两组具有代表性的编码突变蛋白的ADLTE小鼠模型。其中，分泌缺陷的LGI1(E383A)蛋白通过内质网质量控制机制识别并被提前降解，而可分泌的LGI1(S473L)蛋白异常二聚，并选择性地与它的一个受体ADAM22缺陷结合。这两种突变均导致LGI1蛋白功能的丧失，使细胞内LGI1的转运或配体活性受到影响，并在突触LGI1-ADAM22的相互作用减弱时汇聚[18]。该实验表明，LGI1蛋白以及LGI1-ADAM22相互作用的破坏与癫痫密切相关。因此，无论是突变导致LGI1分泌、折叠还是与ADAM22/23连接和组装任一环节出现错误均可以引起功能障碍，从而引起癫痫表型。

2.3其他可能机制 此外，人们还研究了LGI1基因突变与神经兴奋性的关系。研究发现，LGI1在轴突起始段富集，并与ADAM22/23和Kv1共同定位在一个位点[14，19]。而LGI1敲除小鼠Kv1通道密度降低与海马CA3神经元神经元兴奋性增加有关[18]。LGI1 R474Q突变可以干扰ADAM22/23和Kv1通道的共域化[15，19]。同时，LGI1还参与了兴奋性突触的发育。LGI1的生理功能和与癫痫相关的多种LGI1基因突变的确切致病机制尚不完全清楚。此外，ADAM和Kv1也参与了癫痫的发生。因此，可以单独评估ADAM和Kv1基因缺陷是否也可以产生与LGI1基因突变一样的癫痫表型，为LGI1的致病机制提供证据支持。如果弄清楚这些问题可以更有针对性地提出LGI1癫痫的治疗策略。Ho等[18]将与LGI1基因突变相关的癫痫定义为构象性疾病，并发现4-苯基丁酸盐(一种化学校正剂)可恢复LGI1 E383A与ADAM22的折叠和结合，并改善LGI1 E383A模型小鼠增加的癫痫易感性。这为LGI1基因突变相关癫痫的治疗提供了新方法。

3 LGI1抗体相关脑炎的致病机制

3.1影响海马突触传递 Schulte等[20]通过蛋白质组学分析发现了LGI1是突触蛋白复合物的组成部分。既往研究表明，ADAM22作为配体与LGI1结合，突触后致密蛋白95作为突触后支架蛋白参与复合物的形成[21]。2010年，Fukata等[22]首次提出LGI1-ADAM复合物假说，他们认为细胞外分泌的LGI1在突触间隙能连接突触前ADAM23和突触后ADAM22，并与突触前钾通道Kv1.1和由突触后致密蛋白95介导的α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionicacid，

AMPA)受体一起组成跨突触蛋白复合体[1]。Yamagata等[11]发现的LGI1-ADAM22复合物的2∶2异四聚体结构及3∶3异六聚体结构也支持这一假说。越来越多的证据表明，LGI1-ADAM跨膜复合物的破坏与LGI1抗体相关脑炎相关[20，23-24]。Ohkawa等[24]研究发现，LGI1抗体能够靶向作用于LGI1的EPTP重复区，特异性地抑制LGI1与ADAM22/23之间的配体受体相互作用，并可逆地减少大鼠海马神经元的突触AMPA受体簇，而LGI1基因敲除小鼠的海马齿状回AMPA受体水平显著降低。可见，遗传因素或后天因素缺失引起的LGI1-ADAM22相互作用的破坏均会降低AMPA受体功能，导致癫痫表型。关于LGI1缺乏如何引起癫痫发作，Fukata等[25]提出了癫痫发生的解除抑制机制。他们认为海马区的抑制性神经元能介导强烈的反馈或前馈抑制作用，以防止网络过度兴奋。而LGI1-ADAM22相互作用的抑制可以可逆地减少大鼠海马神经元突触AMPA受体簇的数量。如果驱动抑制性中间神经元的AMPA受体功能降低，海马神经网络的整体兴奋性会因去抑制作用而增强，从而引发癫痫发作[25]。然而，Yu等[26]对LGI1缺失突变小鼠中癫痫表型的小鼠进行电生理分析发现，兴奋性神经递质谷氨酸的释放增加，海马中兴奋性突触传递增强。其可能因为LGI1和ADAM22/ADAM23在海马的抑制性间神经元和兴奋性神经元中均有表达，而其中某一个占主导位置，也可能是因为基因敲除的不同造成，因此有必要进行类似的重复实验。

3.2改变神经元兴奋性 急性海马切片的体外电生理记录证实了边缘脑组织-免疫球蛋白G抗体的致病性，并显示出神经元兴奋性的增加[27]。另一份报告显示，在LGI1-/-动物中，神经元兴奋性的增加是由于轴突和突触前Kv1通道表达的大量减少导致[17]。这种Kv1通道表达下调可能发生在干扰AMPA受体表达之前。研究发现，LGI1在轴突起始段表达，并通过调节轴突Kv1.1通道的密度来调节动作电位放电，该通道是D型钾电流的基础[18]。LGI1缺失能导致Kv1.1和Kv1.2的表达下调超过50%，导致轴突D型电流限制谷氨酸释放的能力降低，谷氨酸释放增多，海马网络兴奋性增加，从而导致癫痫发生[18]。LGI1是通过什么途径调节胞质钾通道是下一个需要解决的问题。研究发现，LGI1的缺失减少了Kv1.2的表达，增强了内源性兴奋性，并引起癫痫，这可能是通过改变胞质磷脂酶A2-环加氧酶2信号通路介导,塞来昔布可以修复锥体神经元中的缺陷Kv1.2，从而降低神经元的兴奋性也验证了这一点[28]。此外，人们还发现星形胶质细胞内向整流性钾离子通道4.1(Kir4.1)表达的降低与LGI1相关的癫痫相关，星形胶质细胞Kir4.1功能障碍通过抑制星形胶质细胞特有的K+缓冲功能，使细胞外K+、谷氨酸水平升高，增加神经元的兴奋性[29]。下调Kir4.1表达可增强星形胶质细胞中脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表达，而BDNF是癫痫形成的关键调节因子。BDNF基因的下调或BDNF受体TrkB的抑制已被证明可以抑制癫痫的发展[30]。因此，星形胶质细胞Kir4.1的下调可能参与了LGI1基因突变大鼠癫痫的发生发展。虽然LGI1基因突变下调Kir4.1表达的机制尚不清楚，但有研究表明，上调谷氨酸信号转导可下调星形胶质细胞中Kir4.1的表达[31]，而LGI1基因突变可以增加谷氨酸的突触释放。可见，谷氨酸可能参与了下调LGI1基因突变大鼠星形细胞Kir4.1的表达。但Kv1.1与Kir4.1通道在LGI1相关癫痫发生中的相互作用机制有待进一步研究。

3.3影响突触形成 Thomas等[32]发现，通过应用外源性LGI1可增加突触形成，敲除LGI1可减少体内突触形成。这一发现促使人们研究LGI1在体内和体外对突触形成的影响及其分子机制。人们发现，LGI1可能通过作用于NgR1-TROY-RhoA通路影响突触形成。在突触形成过程中，NgR1和TROY形成受体复合体，调控RhoA信号，使RhoA活性增强，RhoA通过控制肌动蛋白细胞骨架阻断神经突的生长[33-34]。LGI1作为NgR1的配体，通过竞争性拮抗作用阻断髓鞘基NgR1-配体的结合，使RhoA信号通路受阻，从而导致髓鞘诱导的生长锥塌落缺陷[35]。Thomas等[32]的研究表明，NgR1和TROY共表达能显著增加RhoA活性，当LGI1与NgR1和TROY共同表达时，依赖RhoA的细胞收缩被完全阻断，表明LGI1是NgR1-TROY复合物的强大拮抗剂。可见，LGI1通过竞争NgR1使依赖NgR1的RhoA活性降低促进突触形成。而LGI1抗体能通过阻断LGI1与NgR1的相互作用，作用于NgR1-TROY-RhoA通路，影响突触成熟、数量和活性，抑制海马区突触的形成。Zhou等[36]也证实，LGI1在树突和轴突的修剪中均起关键作用，当LGI1抗体存在时，轴突清除功能受损可能导致突触连接不精确，接受区不精细，这种不精确的感官输入可以引起传出信号的失真，从而引起癫痫发作及记忆障碍表型。Petit-Pedrol等[37]研究了LGI1抗体相关脑炎-IgG对突触传递、突触可塑性和记忆的影响，结果发现与未经IgG处理的小鼠相比，IgG处理的小鼠长期突触增强的幅度减少了一半，这验证了LGI1抗体相关脑炎-IgG会导致记忆缺陷。可见，抑制突触可塑性和树突生长可能是引起认知功能障碍的重要致病机制。LGI1促进轴突修剪的具体分子机制尚不清楚，许多与LGI1相关的信号分子可能参与其中。因此，研究LGI1如何调控细胞外基质蛋白和细胞骨架分子，促进轴突清除，将是未来研究的热点。

4 小 结

LGI1在中枢神经系统中有多种功能，其在突触生长、突触间传递及修剪成熟、调节神经元兴奋性中起重要作用。LGI1的致病性包括引起ADLTE的LGI1基因突变的单倍体不足机制及显性-负性机制。LGI1基因突变引起癫痫的机制可能与LGI1蛋白错误折叠而被内质网质量控制机制识别并提前降解导致分泌缺陷有关，部分分泌正常的突变引起癫痫的机制可能与LGI1与ADAM22亲和力的降低有关。LGI1自身抗体通过中和特定的蛋白质-蛋白质相互作用，通过干扰突触传递、改变神经元兴奋性、影响突触的连接致病。研究发现在海马区，补体能通过介导神经元破坏，从而导致颞叶萎缩及持续的认知功能缺陷[38-39]。目前，LGI1抗体的致病性已得到普遍认可，但LG1抗体如何产生特异性尚不清楚，推测与某些病毒感染有关。病毒感染损伤的血脑屏障可能从脑组织中漏出LGI1蛋白进入外周循环，导致LGI1抗体的产生[40]。然而，这种情况并不能解释LGI1自身抗体的选择性产生，因为针对其他分泌蛋白的抗体尚未在患者血清中检测到。下一步，需探明LGI1抗体相关脑炎IgG是否破坏了LGI1二聚作用、抗LRR和抗EPTP抗体是否具有致病性以及它们是否具有不同的作用。