肿瘤浸润淋巴细胞在胃癌中的研究进展

陈倩文，刘璐，龙美玲，谢菲岚，简明威，刘锦涛

(1.广东医科大学研究生学院，广东 湛江 524000； 2.广东医科大学深圳宝安临床医学院 深圳市宝安区人民医院消化内科，广东 深圳 518100； 3.深圳市宝安区中医院内镜室，广东 深圳 518100)

胃癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率位居世界第二，仅次于肺癌[1]。据我国2015年恶性肿瘤发病、病死数据显示，胃癌发病率在男性和女性中分列第二位和第三位，而病死率均列第二位，我国胃癌新发病例和病死病例约占全球的42.6%和45.0%[2]。胃癌患者确诊时大多已处于肿瘤晚期，导致胃癌术后预后较差，而常规的TNM分期通常难以准确评估胃癌术后复发、转移以及生存期等预后情况，因此寻找有效的预后评估方案一直是胃癌研究的热点和难点。肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TIL)是目前关注的重点，TIL是宿主对肿瘤细胞免疫应答的表现，是机体识别和清除肿瘤细胞的基础，TIL的组成、数量、分布及功能状态决定了机体对肿瘤细胞的免疫反应。TIL的存在状态与肿瘤预后密切相关，TIL作为各种人类恶性肿瘤的预后参数，在非小细胞肺癌[3]、食管鳞状细胞癌[4]和乳腺癌[5]中均取得了一定的研究进展。对于胃癌，TIL可能是一种潜在的生物标志物。现就不同亚型TIL的密度、分布、功能状态与胃癌临床病理因素及预后关系的研究进展予以综述。

1 胃癌TIL的组成及作用机制

TIL是一群存在于肿瘤及其间质内、以淋巴细胞为主的异质性免疫细胞，包括T细胞、B细胞、树突状细胞(dendritic cell，DC)以及自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)等。1986年，Rosenberg等[6]首次从新鲜肿瘤组织中分离出TIL，此后的研究相继发现肿瘤组织中广泛存在TIL，且TIL可以渗入基质和肿瘤中心。根据是否存在免疫细胞浸润，肿瘤可分为炎症性肿瘤和非炎症性肿瘤[7]。炎症性肿瘤是指肿瘤细胞被不同的浸润性炎症细胞(T细胞、B细胞、髓系白细胞、NK细胞和DC等)包围，这些免疫细胞在肿瘤发生、发展过程中的作用也不尽相同。T细胞是细胞免疫中的主要效应细胞，按功能其可分为4类，即细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell，Tc细胞)、辅助性T细胞(helper T cell，Th细胞)、调节性T细胞(regulatory T cell，Treg细胞)和记忆T细胞[8]。TIL中的T细胞以CD4+、CD8+为主，包括CD8+Tc细胞、CD4+Th细胞、叉头框蛋白P3(forkhead box P3，FoxP3)+Treg细胞、CD45RO记忆T细胞等亚型[9]。

CD4+T淋巴细胞包括Th1、Th2、Th17、Th22及Treg细胞等亚群，而不同亚群对肿瘤演化的影响差异极大，故CD4+T细胞的作用因其异质性而变得相对复杂。其中，Th1细胞和Th2细胞是Th细胞的两种主要类型，Th1细胞可以激活CD8+Tc细胞，而Th2细胞可以激活体液免疫；在诱导抗肿瘤免疫中，Th1细胞较Th2细胞激活更有效，因此高比值的Th1/Th2被认为是胃癌的有利预后因素[10]。Th17细胞和Th22细胞能产生多种炎症因子，可促进胃癌的发展[11]。Xu等[12]发现，CD4+T细胞能通过磷酸化信号转导及转录激活因子信号通路上调胃癌间充质干细胞中程序性细胞死亡配体1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)的表达，促进胃癌细胞的迁移。CD8+T淋巴细胞是抑制/杀伤T细胞，主要负责特异性清除肿瘤细胞，是人体免疫系统杀伤肿瘤的主要细胞。Lee等[13]通过荟萃分析发现，高密度CD8+T淋巴细胞与胃癌的良好预后相关，可作为胃癌患者良好预后的预测指标。Thompson等[14]研究发现，胃癌瘤内和基质中CD8+T细胞密度的增加与无进展生存期和总生存期呈正相关。然而，Zhuang等[15]使用流式细胞学研究103例胃癌患者血液和肿瘤样本中Tc17细胞的数量和表型发现，分泌白细胞介素-7的CD8+T细胞有促进胃癌进展的作用，提示肿瘤浸润Tc17细胞(分泌白细胞介素-7的Tc细胞)与胃癌患者的预后不良相关。Treg细胞能抑制效应T淋巴细胞的功能，FoxP3表达阳性是其主要特征，FoxP3+Treg细胞阳性率越高，胃癌进展越快，患者存活率越低[16-17]。有研究表明，Foxp3+T细胞与CD4+T细胞以及FoxP3+T细胞与CD8+T细胞之间的数量平衡对抑制肿瘤转移起重要作用，高比值的Foxp3+/CD4+和Foxp3+/CD8+提示预后不良[17-18]。CD45RO是最常用的记忆T细胞标志物，CD45RO+T细胞在许多人类癌症中发挥重要作用。Hu和Wang[19]通过荟萃分析评估肿瘤浸润性CD45RO+T细胞对人类实体瘤预后的影响，发现CD45RO+T细胞浸润与实体瘤中无进展生存期和总生存期呈正相关；高密度肿瘤内CD45RO+T细胞与实体瘤的TNM分期呈负相关。

TIL的抗肿瘤免疫效应主要为细胞免疫效应，肿瘤-免疫循环理论认为，免疫系统识别和清除肿瘤细胞必须经历三个阶段：①在瘤内，死亡的肿瘤细胞释放出特异性抗原DC识别和捕获；②成熟的DC迁移到肿瘤引流淋巴结，将加工后的抗原呈递给幼稚T细胞，刺激其增殖、分化为 Tc、Th和Treg细胞等；③激活的效应T细胞浸润到瘤内，特异性识别和杀死癌细胞，并进一步释放肿瘤特异性抗原，使其进入下一个肿瘤-免疫循环[20-21]。但在绝大多数癌症患者中，免疫系统不能有效地发挥作用：可能由于免疫系统未能识别到肿瘤抗原，将肿瘤抗原视为自身，即表现为免疫耐受；效应T细胞无法浸润到肿瘤病灶，或肿瘤微环境中的抑制因子(或免疫抑制性细胞)抑制效应细胞的功能[22]。此外，免疫系统在清除肿瘤细胞的同时也会对肿瘤细胞的特性进行“重塑”，使其恶性程度更高和抵抗免疫攻击能力更强，即“免疫编辑”[23]。因此，免疫系统在肿瘤细胞发生、发展过程中具有“双刃剑”的作用。TIL位于瘤内或间质，因TIL为肿瘤免疫作用的主要参与者，且TIL亚群种类繁多，不同亚群在肿瘤发生、发展中的作用差异极大，所以对肿瘤预后的影响也不尽相同。

2 TIL在胃癌中的功能状态研究

浸润到肿瘤组织的T细胞功能常处于失调状态，活性较低，因此无法控制肿瘤生长。有证据表明，细胞的无能、衰竭和衰老是导致肿瘤微环境中T细胞功能失调的主要原因[24-25]。目前，常用抑制性受体CD57、T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域分子3(T-cell immunoglobulin mucin domain-3，Tim-3)或程序性细胞死亡受体1(programmed cell death receptor 1，PD-1)的表达水平来表征T细胞的免疫耐受状态，进而研究其与肿瘤之间的关系。

2.1CD57 CD57是存在于CD4+T细胞、分化晚期的CD8+T细胞及NK细胞等细胞膜上的糖蛋白[26]。CD57常用于鉴定增殖能力降低和功能特性改变的终末分化的衰老细胞。TIL作为免疫系统的重要组成部分，在肿瘤微环境中CD57阳性淋巴细胞的功能引起了人们的广泛关注，这些淋巴细胞在许多人类癌症中发挥重要作用。CD57+淋巴细胞通常会在实体瘤中增加，可以说CD57的表达是免疫功能缺陷和复制衰老的特征[26-27]。以往研究提示，CD57分子的表达主要与NK细胞的分化发育有关，CD57+细胞可能就是高度成熟和终末分化的NK细胞[28]。Kared等[29]研究发现，血液和组织中的CD57+T细胞比例与慢性感染或各种癌症及人类衰老的临床预后相关，表明调控衰老CD57+T细胞的数量可能成为预防人类免疫衰老或各种慢性疾病的新方法。陈耀平等[30]研究表明，侵及胃壁全层的胃癌患者CD8+CD57+T细胞的百分率高于未侵及胃壁全层者，表明外周血中CD8+CD57+T细胞百分率增加可能促进肿瘤的局部浸润。这与Akagi和Baba[31]的研究结果一致，该研究通过流式细胞术和细胞内细胞因子分析测定胃癌患者外周血中CD57+T细胞的比例，发现CD57高比例的患者术后存活时间显著短于CD57低比例者。另外，Hu和Wang[26]通过荟萃分析发现，CD57+终末分化的淋巴细胞浸润与实体瘤患者的预后相关，且与胃癌3年和5年生存率均显著相关；此外，CD57+淋巴细胞密度增加与实体瘤淋巴结转移和TNM分期呈负相关。这些发现表明，CD57+淋巴细胞是人类实体肿瘤中抗肿瘤免疫力的重要参与者之一，可延缓肿瘤进展，提示CD57可能是预后的有用生物标志物。

CD57+淋巴细胞增加可提高患者生存率，可能与以下因素有关：CD57+T细胞和NK细胞等淋巴细胞中CD57的表达与颗粒酶A、颗粒酶B和穿孔素等细胞溶解酶的表达增加相关；当表达CD57抗原的CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞被刺激时，可以产生更多的γ干扰素，抑制肿瘤的生长；CD57+NK细胞可通过γ干扰素的分泌上调肿瘤细胞中主要组织相容性复合体Ⅰ类和Ⅱ类分子，使细胞毒性T淋巴细胞识别肿瘤特异性抗原，从而发挥抗肿瘤作用；CD57+NK细胞可以通过NK细胞和DC之间的相互作用增强T淋巴细胞的反应，从而诱导DC的成熟和激活[26,32]。因此推测，CD57+淋巴细胞能够增强肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫反应，并对抗肿瘤的生长和扩散，提高患者的生存率。目前，关于CD57与胃癌预后关系的研究中，CD57主要用于识别TNM分期Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者的NK细胞，而CD57与T细胞的相关研究较少。

2.2Tim-3 Tim-3主要表达于Th1细胞表面，Tim-3与其配体半乳糖凝集素-9结合，通过Tim-3/半乳糖凝集素-9途径产生抑制信号，诱导Th1细胞死亡，负调节Th1细胞免疫应答[33]。此外，在CD8+T细胞、Th17细胞、Treg细胞、DC以及NK细胞等淋巴细胞亚群中也发现了Tim-3的表达[34]。有研究表明，Tim-3是一种免疫负调控分子，在分化和成熟的Th1细胞表面表达，在浸润各种肿瘤组织的T细胞表面Tim-3的数量和密度均增加[35-36]。另有研究表明，Tim-3在多种肿瘤组织中的表达除了与肿瘤的发生、发展密切相关外[34,37]，还与T细胞耗竭有关[33]。目前已知Tim-3与T细胞功能的抑制有关[24,34]，但有关胃癌患者T细胞表面Tim-3表达的研究以及与Tim-3胃癌发展关系的研究相对较少。因此，研究Tim-3在胃癌患者癌旁和癌组织中T细胞表面的表达及其对T细胞功能的影响，可揭示胃癌患者免疫抑制的机制，从而干扰T细胞的免疫抑制状态，这可能是胃癌治疗的新方向。

Yu等[38]建立了胃癌的裸鼠模型，并将Tim-3刺激的T细胞注射到小鼠中，以评估肿瘤的生长，结果发现，与外周血相比，癌旁组织和癌组织中T细胞表面的Tim-3表达水平均显著升高；与癌旁组织相比，癌组织中T细胞表面的Tim-3表达水平也显著升高，表明T细胞表面Tim-3的表达水平与胃癌T分期呈正相关。Tim-3可能通过抑制T细胞分泌肿瘤坏死因子-α和γ干扰素使T细胞功能降低，进而促进肿瘤的发生、发展。另外，Cheng等[39]通过流式细胞术评估胃癌标本和胃炎组织中Tim-3的表达水平发现，胃癌组织中Tim-3的表达水平显著高于胃炎组织；且CD8+T细胞中Tim-3的表达与胃癌患者的性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、浸润深度、组织学类型均无关，仅与TNM分期有关。由此可见，Tim-3可引起T细胞功能障碍或活性降低，负调节免疫应答，与胃癌预后呈负相关，其在细胞上的表达水平是胃癌患者的独立预后因素。

2.3PD-1 PD-1属于CD28蛋白家族，可在T细胞、B细胞、NK细胞和DC等多种免疫细胞表面表达，在肿瘤免疫逃逸过程中发挥关键作用，其机制主要为：效应T淋巴细胞通过T细胞受体与肿瘤细胞中主要组织相容性复合体间的相互作用识别肿瘤细胞；在激活免疫应答后，肿瘤能够在肿瘤细胞表面表达PD-L1，随后PD-L1与PD-1结合，关闭免疫反应使肿瘤细胞逃脱死亡[20]。

目前已知PD-1与T细胞功能的抑制有关[24,40-41]。有学者研究了胃癌患者T细胞表面PD-1分子的表达和功能，发现胃癌患者外周血和癌组织中T细胞表面PD-1的平均表达水平显著升高，表达PD-1的T细胞分泌干扰素的能力显著降低[24,40]。另有研究证明，PD-1或PD-L1在胃癌患者的肿瘤细胞中高表达[42-44]。Deng等[45]在小鼠实验中发现，当PD-L1在慢性发炎的组织和肿瘤中表达时，对T细胞具有负调节作用的PD-L1的治疗性阻断可以增强T细胞效应子的功能。另外，放疗和抗PD-L1药物协同治疗可减少肿瘤浸润性髓样来源的抑制细胞的局部积累，从而抑制T细胞并改变肿瘤免疫微环境。有学者通过免疫组织化学方法研究了PD-1和PD-L1在胃癌患者的表达水平，发现53.8%的胃癌患者PD-1表达阳性(主要限于TIL)，30.1%的胃癌患者PD-L1表达阳性[46]。尽管PD-1和PD-L1在胃癌中的表达与预后密切相关，但结果仍不一致[47]。Zhang等[48]通过荟萃分析评估了PD-L1在胃癌中的预后价值，通过对1 901例患者的研究发现，PD-L1的表达与肿瘤大小及淋巴结状态相关，但与性别、年龄、癌症位置、分化、浸润深度及肿瘤分期无关；同时他们还指出，肿瘤内的PD-L1大多与胃癌患者的无进展生存期密切相关，这为PD-L1靶向治疗胃癌患者提供了有利证据，并推测PD-1或PD-L1的特异性抑制剂可能是影响多种胃癌的潜在治疗候选物。目前已经开发了几种针对抑制PD-1或PD-L1途径的治疗性抗体，如一种针对PD-1的人源化免疫球蛋白G4单克隆抗体，可用于PD-L1阳性的复发性或转移性胃或食管胃腺癌患者，目前正在进行临床试验。

3 TIL的分布与胃癌的关系

在TIL与胃癌关系的研究中，不同淋巴细胞亚群的数量、功能与预后之间的关系是目前最主要的关注点。TIL可以渗入基质和肿瘤细胞，因此可分为肿瘤内TIL和基质TIL。肿瘤内TIL在癌巢上皮组织内直接与肿瘤细胞接触，且细胞之间无间质组织；基质TIL分布于肿瘤细胞间的间质内，不与肿瘤细胞接触；肿瘤内TIL的绝对数量较少、存在的区域范围小、分布的异质性明显，且不易通过苏木精-伊红染色观察；而基质TIL数量相对较多，易于观察评价，且癌巢密度、形态等变化对基质TIL影响较小[49]。以往对胃癌中TIL的研究已经评估了基质和肿瘤内淋巴细胞，其中标准苏木精-伊红染色切片的视觉评估是最常用的测量TIL的方法[50-51]。基于使用苏木精-伊红染色的载玻片对TIL的组织病理学分析，Kang等[52]提出，基质TIL可定义为包含浸润性单核炎症细胞的肿瘤基质区域，而肿瘤内TIL可定义为肿瘤细胞内的上皮内淋巴细胞或单核细胞。这表明，基质TIL可用于预测无复发生存期和无进展生存期。另一项研究发现，增加肿瘤内TIL与改善癌症特异性生存显著相关[53]。事实上，基质TIL在乳腺癌中被认为是一个优越、可重复的参数[51]。尽管如此，目前对于TIL分布与胃癌预后的关系尚无共识，且研究胃癌患者TIL分布的方法还需要标准化。

4 小 结

胃癌内的Treg细胞、Th17细胞、Th22细胞、CD57、Tim-3以及PD-1通常与不良预后相关，而高比值的Th1/Th2、CD8、CD45RO+T细胞通常与良好预后相关。TIL在胃癌的预后方面发挥重要作用，是胃癌患者潜在的生物标志物和良好预后的准确预测因子。另外，肿瘤组织及其周围组织的免疫反应与患者预后密切相关。相信随着更精确的免疫浸润分析方法的发展，不同的淋巴细胞亚群的代表意义将越来越清楚。特别是对于富含TIL的肿瘤来说，TIL可以作为治疗肿瘤的重要生物标志物，这有助于未来靶向免疫细胞的常规疗法和新疗法的研究。因此，了解TIL对胃癌的作用机制，预示着个性化治疗的新机遇。