贮藏温度对真空冻干发酵剂发酵乳杆菌grx07活性的影响

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(1.扬州大学,江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室,江苏扬州 225127; 2.广西水牛乳工程技术研究中心,广西南宁 530000; 3.丹阳市康力乳制品有限公司,江苏镇江 212000)

随着人们保健意识的增强,乳酸菌作为有益菌被深入研究并广泛添加于各种食品中,如保健食品、医药等。真空冷冻干燥法是一种能较好保持发酵剂活力的方法,但贮藏过程中多种因素可能会引起细胞壁、细胞膜结构和DNA等的变化,从而导致乳酸菌的活菌数下降,发酵活力降低甚至是失活[1-3]。

研究表明影响冻干发酵剂贮藏期菌体活力的因素包括发酵剂的制备方法、保护剂的成分、贮藏温度、水分含量、贮藏环境中的相对湿度、氧含量等[4-10]。发酵剂制备的干燥方法有低温干燥法、喷雾干燥法、真空冷冻干燥法。其中,低温干燥法和喷雾干燥法制备的发酵剂活菌含量低,而真空冷冻干燥法制备的发酵剂活化后不仅活菌数量高[11-13],还便于贮藏和运输。贮藏温度是影响发酵剂活力的关键因素之一,Simpson等[14]将喷雾干燥的双歧杆菌放在15和25 ℃贮藏时,观察到所有双歧杆菌的活力显著下降,而在4 ℃贮藏能长期保持活力;Pedroso等[15]的研究表明,微胶囊化的益生菌在20 ℃贮藏时极不稳定;在7 ℃贮藏90 d后,细胞存活率只有20%;在-80 ℃贮藏90 d,细胞存活率保持在81.1%;马振兴[16]将嗜酸乳杆菌菌粉真空袋装后置于室温和4 ℃下保藏180 d,发酵剂活菌数下降1～5个数量级不等,而在-18 ℃贮藏180 d,发酵剂活菌数数量级均保持1011cfu/g不变。因此,发酵剂的贮藏温度对发酵剂的活力有着显著的影响。

发酵乳杆菌grx07是从江苏如皋长寿村人群肠道中分离获得,前期的研究表明其具有显著降低慢性酒精性肝损伤,对慢性酒精肝损伤有很好的保护作用;此外,还具有显著体外抗氧化能力和抑制致病菌能力[17]。通过高密度发酵及真空冻干法已经获得高活菌数的grx07发酵剂,为研究贮藏温度对grx07发酵剂活力的影响,本试验主要从活菌数、水分活度、存活率、发酵活力、乳酸脱氢酶、β-半乳糖苷酶及ATP酶的活力等方面研究不同贮藏温度对grx07发酵剂活力的影响,为发酵乳杆菌grx07发酵剂的开发提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

发酵乳杆菌grx07 江苏如皋长寿村人群肠道中分离获得(样本来自92岁健康男性);脱脂乳 新西兰;MRS液体培养基、MRS固体培养基 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;ATP试剂盒 南京建成生物科技有限公司;其他试剂 分析纯,国药集团。

JF-SX-500型全自动灭菌锅 日本TOMY公司;DNP-9272型培养箱 上海精宏实验设备有限公司;FreeZone 18L冻干机 美国LABCONCO公司;DZ400-ZD型真空包装机 上海余特包装机械制造有限公司;LabSwift-aw水分活度测试仪 瑞士novasina;5804R型高速冷冻离心机 德国Eppeendorf公司;Multiskan go酶标仪 美国Thermo Electron公司。

1.2 实验方法

1.2.1 冻干发酵剂的制备 保护剂的配比为脱脂乳12.71%,蔗糖11.88%,谷氨酸钠4.22%,甘油2.95%灭菌。无菌环境下保护剂和发酵剂按照体积比以1∶1的比例混匀,制成细胞悬液,放入-80 ℃冰箱预冻后在真空冻干机中冻干,冻干好的发酵剂粉碎后用锡箔袋真空包装,分别置于20 ℃贮藏5个月,置于4、-20 ℃贮藏12个月,1～3月每半月取样,4～12月则每月取样分别测定发酵剂的活菌数、存活率、水分活度、发酵活力和关键酶活。

1.2.2 发酵剂活菌数及存活率的测定 活菌数的测定:参照国标GB 4789.35-2016[18]的方法测定发酵剂的活菌数。菌体冻干前后存活率按下式计算:

式中:μ表示菌体存活率,%;A表示未预冻或未冻干前活菌数,cfu/mL;B表示预冻后或冻干后的活菌数,cfu/mL。

1.2.3 水分活度的测定 用全自动水分活度仪测定乳酸菌冻干后的水分活度。

1.2.4 发酵剂发酵活力的测定 通过测定发酵剂发酵脱脂乳产酸pH来反应发酵剂的发酵活力,将三种温度下贮藏的冻干发酵剂以12%(m/m)比例接至脱脂乳中,37 ℃培养6 h后,利用pH计测定发酵乳的pH。

1.2.5 关键酶活的测定

1.2.5.1 粗酶液的制备 移取冻干后的菌粉溶于10 mL无菌生理盐水,用生理盐水清洗两次后,用10 mL的含2 mmol/L EDTA的磷酸盐缓冲溶液重悬菌体。取5 mL于试管中进行冰浴超声破碎,超声时温度不超过4 ℃,超声功率为25 W持续5 s,间隙5 s,循环90次,破碎15 min。破碎后在4 ℃,9000 r/min的条件下离心12 min,取上清液,即为粗酶液,用于相关酶活的测定。

1.2.5.2β-半乳糖苷酶活力的测定 绘制标准曲线:配制1 μmol/mL的ONP(邻硝基酚)溶液,取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL,用pH7.0的磷酸盐缓冲溶液补足体积至1.0 mL,37 ℃水浴10 min后立刻加入的0.5 mol/L的Na2CO3溶液4 mL,第一个为空白,测定溶液的OD420 nm。以ONP含量为横坐标,OD420 nm为纵坐标,绘制标准曲线。

β-半乳糖苷酶活性测定:以ONPG为底物,在β-半乳糖苷酶的作用下生成黄色产物ONP,于420 nm处测得吸光值,通过标曲找到对应浓度,按照稀释倍数换算成最终酶活。酶活具体测定方法:取1.00 mL酶液,37 ℃水浴10 min,加入1.00 mL pH为7.0的PBS(含20 mmol/L ONPG)缓冲液,37 ℃水浴10 min后立即加入3.00 mL的0.50 mol/L Na2CO3终止反应并立即测定吸光度。

式中:W表示β-半乳糖苷酶活力,U;A表示从标曲上查到的ONP浓度,μmol/mL;B表示反应时间,min;C表示取样体积,mL;D表示样品蛋白浓度,mg/mL。

1.2.5.3 乳酸脱氢酶活力的测定 参照文献[19]测定乳酸脱氢酶活力,反应体系为0.2 mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.30),30 mmol/L的丙酮酸钠,及6.6 mmol/L的NADH共3 mL,预热至25 ℃后加入0.1 mL粗酶液反应,立即在340 nm处测定吸光值,每30 s读取一次,连续5 min,计算每分钟降低的吸光值,按照下面公式计算酶活力:

式中,V总:反应总体积,mL;V样:样品体积,mL;ΔOD340 nm:每分钟光密度的降低值;6.22:毫摩尔消光系数。

1.2.5.4 ATP酶活力的测定 按照试剂盒说明的方法测定Ca2+-ATP、Mg2+-ATP、Na+K+-ATP酶活力。

1.3 数据处理

实验中每个处理重复三次,采用SPSS 25和Origin 2018进行数据分析及作图。

2 结果与分析

2.1 贮藏温度对发酵剂活菌数及存活率的影响

将真空冷冻干燥制得的发酵剂grx07置于20 ℃保藏5个月,置于4和-20 ℃保藏12个月,贮藏期间的活菌数及存活率的变化情况如图1所示,可以看出grx07在20 ℃贮藏时活菌数快速下降,2个月时低于1×1011cfu/g,3个月后存活率低于1%;在4 ℃贮藏时,活菌数缓慢下降,6个月时,存活率为20%,活菌数为1.50×1011cfu/g,12个月时,活菌数仅为存活率仅为4.45%左右;在-20 ℃贮藏时,活菌数变化不明显,12个月时,存活率保持在51.05%,活菌数为3.78×1011cfu/g,说明-20 ℃贮藏能较好的保持发酵剂grx07的活菌数数量。

图1 不同温度下发酵剂贮藏期间 活菌数(a)及存活率(b)的变化Fig.1 Changes of viable counts(a)and survival rate(b) during storage of starter at different temperatures

2.2 贮藏温度对发酵剂水分活度变化的影响

本次实验制得的冻干发酵剂grx07测得初始水分含量为1.58%±0.07%,水分活度为0.12,处于较好的状态。将发酵剂置于20 ℃保藏5个月,4和-20 ℃保藏12个月,贮藏期间测得其水分活度的变化结果如图2。在三种贮藏温度下,随着时间的延长,grx07的水分活度呈上升趋势,其中在20 ℃贮藏的grx07的水分活度上升最快,3个月时水分活度大于0.23;在4 ℃贮藏时12个月菌粉水分活度为0.28;在-20 ℃贮藏12个月的菌粉水分活度为0.21。

图2 不同温度下发酵剂贮藏期间水分活度的变化Fig.2 Changes of water activity during storage of starter at different temperatures

2.3 贮藏温度对乳酸菌发酵活力的影响

发酵活力是发酵剂的重要指标,可通过测定发酵剂的代谢产物来判断发酵剂的活力,发酵乳杆菌grx07的代谢产物主要为乳酸,因此通过测定发酵乳的pH来判断发酵剂的活力,在相同的发酵时间内,发酵乳的测定pH越低,说明发酵剂代谢产酸能力越强,发酵活力越高,反之则越低。将不同贮藏温度不同贮藏时间下的发酵剂进行发酵试验,测定对应的发酵乳的pH,结果如图3所示,可以看出随着贮藏时间的延长,三种贮藏温度下发酵剂的发酵乳pH都在升高,说明发酵剂的活力在降低;在20 ℃贮藏3个月时发酵剂发酵乳的pH升高至6.00,发酵剂的活力降低最快;在4 ℃贮藏时前4个月发酵pH保持在4.00以下,12个月后发酵pH升高至4.83,发酵活力较低;-20 ℃贮藏12个月发酵pH保持在4.30,说明低温能较好的保证发酵剂grx07长期贮藏的发酵活力。

图3 不同温度下发酵剂贮藏期间发酵活力的变化Fig.3 Changes of fermentation vigor during fermentation of fermenting agent at different temperatures

2.4 贮藏温度对grx07发酵活力相关酶活性的影响

2.4.1 贮藏温度对β-半乳糖苷酶活力的影响 不同贮藏温度条件下测定grx07中β-半乳糖苷酶的酶活,结果如图4所示,三种温度下贮藏的grx07的β-半乳糖苷酶活力随贮藏时间的延长都有不同程度的下降;其中在20 ℃贮藏的β-半乳糖苷酶在贮藏2个月后迅速下降,5个月时活力下降到0.68 U,仅保持了初始酶活的8.1%;在4和-20 ℃贮藏12个月时,酶的活力变化不大,分别为5.58和7.28 U,保持在较高水平。

图4 不同温度下发酵剂贮藏期间 β-半乳糖苷酶活力的变化Fig.4 Changes of β-galactosidase activity during storage of starter at different temperatures

2.4.2 贮藏温度对乳酸脱氢酶活力的影响 将发酵剂置于20 ℃保藏5个月，在4和-20 ℃保藏12个月,测定发酵剂grx07乳酸脱氢酶活力在贮藏器期间的变化,结果如图5所示,随着贮藏时间的延长,三种温度下grx07中的乳酸脱氢酶的活力下降;但在20 ℃贮藏时乳酸脱氢酶活力下降较快,3个月时仅剩50%;而在4和-20 ℃贮藏12个月时乳酸脱氢酶活力保持较好,分别为2.2和2.6 U,说明低温条件下能较好保留酶活。

图5 不同温度下发酵剂贮藏期间乳酸脱氢酶活力的变化Fig.5 Changes of lactate dehydrogenase activity during storage of starter at different temperatures

2.5 贮藏温度对乳酸菌ATP酶活力的影响

发酵剂grx07 ATP酶活力在贮藏器期间的变化如图6所示,ATP酶(Na+-K+-ATP、Mg2+-ATP、Ca2+-ATP酶)在三种贮藏温度下都有不同程度的降低,其中在20 ℃贮藏时酶活力下降最快,贮藏5个月时Na+-K+-ATP、Mg2+-ATP、Ca2+-ATP三种酶活力仅保持了初始的29.87%、49.02%、21.31%;在4 ℃贮藏时活力下降较慢,贮藏12个月时,Na+-K+-ATP、Mg2+-ATP、Ca2+-ATP三种酶的活力分别保存50%以上的初始酶活;而在-20 ℃贮藏12个月时酶活力则保持70%以上的初始酶活。

图6 不同温度下发酵剂贮藏其间Na+-K+-ATP酶(a)、 Mg2+-ATP酶(b)、Ca2+-ATP酶(c)酶活力的变化Fig.6 Changes of Na+-K+-ATPase(a),Mg2+-ATPase(b) and Ca2+-ATPase(c)activity in fermentation agents stored at different temperatures

3 讨论与结论

真空冷冻发酵剂需具有活菌数高、贮存时间长,菌种稳定等特点。然而,在贮藏期间,贮藏温度[14-16]、水分含量[20-21]、贮藏环境中的相对湿度[22]、氧含量[23-24]等均可以影响发酵剂的活力。而本实验以发酵剂grx07的存活率、活菌数、水分活度、发酵活力及影响乳酸菌代谢活力的关键酶活为指标,测定20、4、-20 ℃三种不同贮藏温度发酵剂grx07活力的影响。

研究表明,储藏期间的发酵剂存活率与储存温度成负相关,发酵剂grx07在-20 ℃贮藏12个月的存活率最高,活菌数保持在3.78×1011cfu/g,在此温度下,发酵剂水分活度在贮藏期内上升较慢。水分活度是影响发酵剂稳定性的重要原因,Mille等[25]的实验数据显示细胞含水量与细胞存活率成正相关。而Kurtmann等[26]发现冻干发酵剂的水分活度在0.11～0.22之间时菌体存活率较高,当水分活度大于0.22时,易发生氧化或褐变,对细胞造成一定的损害,导致贮藏性降低。发酵剂grx07在冻干过程中,会脱去自由水和部分结合水,细胞进入休眠期,但在贮藏过程中,逐渐吸收环境中的水分,使水分活度上升,但在-20 ℃贮藏12个月后水分活度仍低于0.21。

发酵剂的发酵活力是发酵剂活菌数之外的另一个用于衡量冻干发酵剂能否直接用于生产的重要指标。利用不同温度贮藏下的发酵剂制备发酵乳,-20 ℃贮藏12个月后发酵活力最好且显著高于20 ℃贮藏的发酵活力,与菌种发酵活力相关的酶主要有乳酸脱氢酶、β-半乳糖苷酶及ATP酶,其中乳酸脱氢酶是乳酸菌利用碳源将丙酮酸转化为乳酸的关键酶,其活力大小是影响乳酸菌产酸能力的因素之一,β-半乳糖苷酶是乳酸菌乳糖代谢过程的关键酶,能将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖,其活力高低是反应发酵剂活力高低的因素之一,而ATP酶对维持细胞生理功能有着非常重要的作用,分为三种,Na+-K+-ATP是细胞质膜双分子层中的一种蛋白质,具有载体和酶的作用,催化ATP水解供能,维持细胞膜两侧的膜电位、调节细胞渗透压,为营养物质的吸收提供动力等方面起着重要作用;Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶是另两种重要的膜酶,主要功能是调节细胞内Ca2+和Mg2+的浓度[27],因此乳酸菌ATP酶活力大小对乳酸菌活力有着重要的影响。发酵剂grx07乳酸脱氢酶和β-半乳糖苷酶在贮藏期内都呈下降的趋势,但在-20 ℃贮藏酶12个月活力仍保持在80%以上。三种ATP酶在三种贮藏温度下都有不同程度的降低,其中在20 ℃贮藏时酶活力下降最快,而在-20 ℃贮藏12个月时酶活力则保持70%以上的初始酶活。因此,发酵剂在-20 ℃贮藏保持较高活力可能是因为低温酶变性缓慢,使发酵活力相关的酶在贮藏期间仍具有较高的活力。

本研究表明贮藏温度越低,在较长的贮藏时间内,发酵剂活力保持相对越高。贮藏期内保持高活性是真空冷冻发酵剂用于生产的一个必须环节,但发酵剂贮藏期活力的变化是多因素相互作用的结果,因此,在本研究的基础上,还需要对贮藏期影响发酵剂活力的其他因素如水分含量、贮藏环境中的相对湿度、氧含量等进行进一步的系统研究。