免疫性卵巢早衰小鼠外周血CD4+CD25+ Treg细胞及其相关因子变化与Tim-3的关系

张于念，田海清，腊晓琳

新疆医科大学第一附属医院，乌鲁木齐830054

卵巢早衰(POF)是指女性在40岁之前出现卵巢生殖内分泌功能衰退，导致月经不规律、闭经、不孕及围绝经期表现的一种常见妇科疾病[1]。据统计，1%～3%育龄女性患有此病。近年来随着生活工作压力增加，POF发病率逐年上升且趋向年轻化[2]。迄今为止，POF的发病机制尚未完全明确。近年来陆续有研究发现，POF的发生发展与细胞免疫功能异常密切相关。调节性T淋巴细胞(Treg)是一类具有免疫无能性和免疫抑制性的T淋巴细胞亚群，在调控自身免疫性T细胞活化增殖，维持自身免疫耐受以及预防自身免疫性疾病等方面起关键作用[3]。Treg细胞数量减少导致卵巢免疫反应过度形成自身免疫性卵巢炎，可能是POF的发病机制之一。T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(Tim-3)是近年新发现的T细胞表面负性调节分子，已有研究显示其在哮喘、类风湿关节炎等自身免疫性疾病中表达失衡，且在Treg细胞上表达异常[4,5]。2018年11月～2019年1月，我们构建了免疫性POF小鼠模型，分析Tim-3与CD4+CD25+Treg细胞及相关因子转化生长因子β1(TGF-β1)、γ干扰素(IFN-γ)的关系，探讨其在POF发生发展中的作用，为POF发病机制、临床诊疗及预防提供新的理论基础和研究方向。

1 材料与方法

1.1 主要材料 实验动物：BALB/c雌鼠30只,6～8周龄，体质量18～24 g,SPF级，新疆医科大学实验动物中心提供；于室温22～25 ℃、湿度40%～70%、光照12 h环境中,普通饲料饲养，自由进食水。试剂：小鼠卵透明带3(ZP3)的第330～342个氨基酸，经HPLC分析纯度>90%，由上海奥科有限公司合成；完全弗氏佐剂(CFA)、不完全弗氏佐剂(IFA)，均购于美国Sigma公司；小鼠雌二醇(E2)、促卵泡素(FSH)、抗缪勒管激素(AMH)、TGF-β1、IFN-γ ELISA试盒，均购于武汉华美生物工程有限公司；卵母细胞透明带糖蛋白3抗体(pZP3)、Tim-3抗体，均购于北京博奥森生物技术有限公司；APC标记的仓鼠抗小鼠CD3单克隆抗体、FITC标记的大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体、PerCP-Cy 5.5标记的大鼠抗小鼠CD25单克隆抗体、PE标记的小鼠抗小鼠Tim-3单克隆抗体，均购于美国BD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组、建模及取材 适应性喂养1周后，通过阴道细胞涂片筛选正常周期小鼠30只，随机分为模型组20只和对照组10只。取10 mg pZP3加入10 mL三蒸水中，按1∶1分别与CFA或IFA混匀制成免疫试剂、免疫强化试剂。0周时于模型组小鼠足底脚垫、腹部皮下多点注射0.15 mL免疫试剂，2周、4周时在同样部位注射免疫强化试剂0.15 mL；对照组小鼠在同样时间、部位注射生理盐水0.15 mL。每日8：30观察雌鼠阴道分泌物涂片，瑞氏吉姆萨染色后光学显微镜观察动情周期。动情周期判断标准：①动情前期：多为有核上皮细胞，偶有少量无核角化上皮细胞，无白细胞；②动情期：全部为无核角化上皮细胞；③动情后期：有核上皮细胞、无核角化上皮细胞及白细胞；④动情间期：有大量白细胞及少量黏液。小鼠正常动情周期为5～6 d，包括动情前期9～18 h、动情期6～12 h、动情后期30～48 h、动情间期36～42 h。如动情周期紊乱，小鼠毛色暗淡，体质量减轻，活动减少，则表示造模成功，并经血清检测及组织学验证构建效果。第5周时，两组小鼠摘眼球取血置于抗凝管，用于ELISA和流式细胞学分析；颈椎脱臼法处死，超净工作台下取两侧卵巢于Bouin固定剂中固定24 h，转移至70%乙醇储存，用于免疫组化检测。

1.2.2 POF建模的血清、组织学验证 ELISA法检测小鼠血清FSH、LH、AMH，按试剂盒说明书操作。小鼠卵巢梯度乙醇脱水，石蜡包埋切片，HE染色，在光学显微镜下观察其形态学改变。

1.2.3 外周血Tim-3+CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Treg检测 采用流式细胞学分析。将血液放入抗凝管，加红细胞裂解液震荡，静置10 min。加PBS后离心去上清，200目筛网过滤。使用PBS重悬，台盼蓝染色检测活性，计数后用PBS调整细胞密度至1×106/mL。在外周血PBMC中加入CD3-APC2、CD4-Percp、Tim-3-FITC、CD25-Pecy7各2 μL，室温避光15 min，PBS洗涤2次，入流式细胞仪检测Tim-3+CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Treg细胞比例。

1.2.4 血清CD4+CD25+Treg细胞相关因子IFN-γ、TGF-β1检测 采用ELISA法检测血清IFN-γ、TGF-β1，按试剂盒说明书操作，在酶标仪450 nm波长处测定每孔吸光度。

1.2.5 卵巢中Tim-3检测 采用免疫组化法。将卵巢组织石蜡切片置于60 ℃恒温烤箱烘烤1 h，放入二甲苯溶液中脱蜡；梯度乙醇脱水，PBS冲洗。3%过氧化氢中室温孵育15 min以阻断内源性过氧化物酶活性。用柠檬酸钠抗原修复，室温孵育1 h；滴加一抗Tim-3兔抗小鼠抗体，4 ℃过夜；次日PBS冲洗后滴加二抗，室温孵育30 min；PBS冲洗，DAB显色；加入苏木素复染3 min冲洗，1%盐酸乙醇分化，PBS冲洗；梯度乙醇脱水，中性树胶封片；光学显微镜下观察。Tim-3阳性细胞胞质呈现棕黄色，在400倍视野下采用Image-Pro 6.0图像分析软件测算Tim-3的平均光密度值(MOD)，以此表示Tim-3相对表达量。

2 结果

2.1 POF建模的血清、组织学验证结果 与对照组比较，模型组血清FSH增高而E2、AMH降低(P均<0.05),见表1。对照组卵巢切片可见较多功能性卵泡(原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡)，颗粒细胞排列整齐(图1)；模型组卵巢萎缩纤维化，卵泡形态不规则且功能性卵泡数目明显减少，可见大量闭锁卵泡，颗粒细胞排列紊乱，卵泡及间质有大量淋巴细胞浸润(图1)。

表1 两组小鼠血清E2、FSH、AMH水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

图1 小鼠卵巢组织HE染色(×100)

2.2 两组外周血Tim-3+CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Treg数量比较 与对照组比较，模型组小鼠外周血Tim-3+CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Treg数量均减少(P均<0.05)。见表2。

表2 两组外周血Tim-3+CD4+CD25+ Treg、CD4+CD25+ Treg数量比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.3 两组血清CD4+CD25+Treg细胞相关因子IFN-γ、TGF-β1水平比较 与对照组比较，模型组血清TGF-β1水平下降而IFN-γ水平升高(P均<0.05)。见表3。

表3 两组血清CD4+CD25+ Treg细胞相关因子IFN-γ、TGF-β1水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.4 两组卵巢Tim-3表达比较 模型组卵巢中Tim-3表达量MOD值为0.13±0.02，低于对照组为的0.25±0.01(P均<0.05)。见图2。

图2 卵巢Tim-3的表达的免疫组化染色(×400)

2.5 模型组卵巢Tim-3表达与外周血Tim-3+CD4+CD25+Treg及其相关因子的关系 相关性分析显示，模型组卵巢Tim-3表达与外周血Tim-3+CD4+CD25+Treg、TGF-β1水平呈正相关(r分别为0.931、0.909，P均<0.05)，与IFN-γ呈负相关(r=-0.886，P<0.05)

3 讨论

卵巢是女性的生育调控中心，其功能减退严重影响女性的生殖健康和心理健康。据统计，约30%的POF与自身免疫失调有关[6]。免疫性POF患者多表现为外周血淋巴细胞亚群失调，并存在针对卵巢的特异性抗体。卵巢组织中浆细胞及淋巴细胞浸润，导致卵巢的免疫反应过度形成自身免疫性卵巢炎[7]。在本研究中，与对照组比较，模型组血清FSH增高而E2、AMH降低；模型组卵巢萎缩纤维化，颗粒细胞排列紊乱，功能性卵泡大量减少，卵泡及间质可见大量淋巴细胞浸润。以上均提示卵巢结构破坏、卵母细胞受损，从血清和病理学角度证明POF小鼠建模成功。

CD4+CD25+Treg细胞主要通过细胞间直接接触或分泌抑制性细胞因子来抑制自身效应性细胞活化，参与免疫负调节，维持自身免疫耐受[8]。大量研究显示，其在促进卵泡发育成熟并排卵、维持卵巢-卵泡微环境的稳定性中不可或缺[9]。切除新生小鼠胸腺会导致小鼠自身免疫性卵巢疾病的发生；从正常成年雌鼠卵巢淋巴结过继转移Treg细胞至胸腺切除鼠后数日，可在该鼠体内获得卵母细胞，并正常受精发育成胚胎[10，11]。本研究结果显示，模型组外周血CD4+CD25+Treg低于对照组。这提示Treg细胞数量减少，效应T细胞增殖调控能力减弱，导致卵巢的免疫反应过度形成自身免疫性卵巢炎,可能是导致POF发病的机制。

TGF-β1和IFN-γ是Treg细胞分泌的细胞因子。Treg细胞减少的同时，伴随了两种因子的改变。TGF-β1参与了卵母细胞成熟和类固醇激素的生成，其水平降低可造成卵泡发育障碍和排卵异常[12,13]。本研究结果显示，模型组血清TGF-β1低于对照组，提示POF与TGF-β1的减少密切相关。短暂的IFN-γ升高是排卵的关键，而高浓度的IFN-γ则会抑制排卵；同时可诱发体液免疫，导致卵巢抗原成分的靶细胞损伤或凋亡，造成卵泡过度闭锁，卵巢功能受到损害。本研究结果显示，模型组血清IFN-γ显著高于对照组，提示其在POF的发病中起作用。

Tim-3是近年来新发现的一种T细胞表面负性调控分子，与其配体Galectin-9结合后，可诱导Th1细胞凋亡和功能衰竭，从而降低细胞免疫功能[14,15]。Banerjee等[16]发现，Tim-3可通过调节Treg细胞参与过敏、炎症性疾病和自身免疫病等。本研究免疫组化检查发现，模型组卵巢Tim-3表达低于对照组，提示POF中Tim-3呈现异常表达状态；进一步通过流式细胞学分析发现，模型组小鼠外周血Tim-3+CD4+CD25+Treg细胞低于对照组，且模型组卵巢Tim-3表达与外周血Tim-3+CD4+CD25+Treg、TGF-β1水平呈正相关而与IFN-γ呈负相关。因此，Tim-3降低可能抑制了Treg细胞活性，使Treg/Th17细胞失衡，导致抑制性细胞因子TGF-β1分泌减少、炎症因子IFN-γ分泌增加，触发卵泡闭锁过程；同时IFN-γ刺激MHC-Ⅱ表达，诱发体液免疫，导致B细胞产生自身抗体攻击卵巢，逐步造成POF。因此我们推测，促进Tim-3分子的表达，可能会增加Tim-3+CD4+CD25+Treg细胞比例，从而抑制卵巢功能不全者疾病的进展。

综上所述，免疫性POF小鼠外周血Tim-3+CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Treg数量均减少，血清TGF-β1水平下降而IFN-γ水平升高；且卵巢组织Tim-3分子表达降低，并与外周血Tim-3+CD4+CD25+Treg、TGF-β1水平呈正相关而与IFN-γ呈负相关。因此我们推测，Tim-3分子可通过调控Treg细胞比例在POF的发生和发展过程中起重要作用，为进一步认识POF的发病机制提供了理论基础，并为临床治疗提供了新的方向和策略。