超高效液相色谱-串联质谱法测定复合调味料中爱德万甜的不确定度评定

张小刚，王霞，王卫东，范艳红，孙洪峰，*

（1.康师傅控股有限公司食品安全研究中心，上海201101；2.上海市农产品质量安全检测中心，上海201708；3.徐州工程学院食品（生物）工程学院，江苏徐州221111）

爱德万甜（N-{N-[3-（3-羟基-4-甲氧基苯基）丙基]-L-a-天冬氨酰}-L-苯丙氨酸-1-甲酯）是一种新型低热量甜味剂，其甜度是蔗糖的20 000 倍[1]。美国食品药品监督管理局、欧盟食品安全局批准爱德万甜可以作为甜味剂和增味剂加入至食品中[2-3]。我国也于2017年10 月由国家卫生健康委员会发布第8 号公告正式批准爱德万甜可作为食品添加剂用于发酵乳、饮料、复合调味料等制品中[4]。

不确定度是指由于测量误差的存在，对被测量值的不能肯定的程度，是检测结果的重要组成部分。通过对检测过程中各不确定度来源进行评定来反映检测结果的可靠性。食品中常用的甜味剂主要有三氯蔗糖、安赛蜜、糖精钠、甜蜜素等物质，相关检测方法及不确定度评定报道较多[5-8]。目前，国内外测定爱德万甜的方法较少，主要为液相色谱法[9-11]和液相色谱-串联质谱法[12-14]。而关于复合调味料中爱德万甜的不确定度评定的相关文献尚未见发表。根据JJF1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》规定[15]，对试验中的不确定度来源进行分析并建立相应的数学模型。通过对数学模型中各分量的不确定度评定，找到影响结果可靠性的主要因素，为本试验及其他类似测定的正确评价提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Triple Quad 4500 超高效液相色谱-串联质谱仪：美国SCIEX 公司；5810R 冷冻离心机：德国Eppendorf公司；Milli-Q 超纯水仪：美国 Millipore 公司。

甲醇、乙腈、正己烷、甲酸（色谱纯）：德国CNW 公司；水为超纯水；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、C18、石墨化炭黑（graphitizing of carbon black，GCB）吸附剂：上海安谱实验科技股份有限公司；爱德万甜标准品（纯度≥97.0%）：美国SIGMA 公司。

1.2 试验方法

准确称取1 g（精确至0.000 1 g）样品于50 mL 塑料离心管中，加入 10 mL 甲醇-水（50 ∶50，体积比）振荡提取10 min，8 000 r/min 离心5 min，上清液转移至25 mL 容量瓶中。残留物再用 10 mL 甲醇-水（50 ∶50，体积比）振荡提取10 min，离心，合并两次上清液并定容至25 mL。取1 mL 上清液于装有200 mg C18和100 mg PSA的2 mL 塑料离心管中，涡旋混匀1 min，10 000 r/min离心2 min，上清液经0.22 μm 滤膜过滤至进样瓶中，供超高效液相色谱-串联质谱（ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLCMS/MS）分析。

1.3 数学模型

根据方法建立测定爱德万甜的数学模型如下：

式中：X 为样品中爱德万甜的含量，μg/kg；c 为由标准曲线得出的待测液中爱德万甜的浓度，μg/L；V 为定容体积，mL；frep为重复性因子。

2 结果与分析

2.1 不确定度来源分析

液相色谱-串联质谱法测定复合调味料中爱德万甜的不确定度主要有以下几个来源：

1）标准溶液配制引入的不确定度；

2）样品称量引入的不确定度；

3）样品定容引入的不确定度；

4）测量重复性引入的不确定度；

5）最小二乘法拟合引入的不确定度。

2.2 各分量不确定度的计算

2.2.1 标准溶液配制引入的不确定度

2.2.1.1 标准物质不确定度

查标准物质证书，爱德万甜标准品的纯度≥97.0%，按97%～100%矩形分布考虑，半宽度为3%/2=1.5%，包含因子属B 类评定，爱德万甜标准物质的不确定度为：

2.2.1.2 标准物质称量引入的不确定度

标准品称量为100 mg，天平的最大误差为0.2 mg，按矩形分布考虑，包含因子则由天平的最大允许误差引入的不确定度为：

3）配制标准储备液过程中由定容体积变化引入的不确定度

标准品配制所使用的10 mL A 级容量瓶20 ℃时的容量允差为±0.02 mL[16]，按矩形分布考虑，包含因子属B 类评定，则：

实验室的温度波动范围一般为±5 ℃，20 ℃水体积膨胀系数为2.1×10-4/℃，甲醇体积膨胀系数为1.2×10-3/℃，相较于水和甲醇的体积膨胀，容量瓶的体积膨胀可以忽略不计[17]。试验过程中使用的甲醇溶液（1 ∶1，体积比）的平均体积膨胀系数为 7.05×10-4/℃，由此引起的体积变化为：

按矩形分布考虑，则由体积变化引入的不确定度为：

由公式（3）、（4），合成标准储备液定容的相对标准不确定度为：

使用100 μL 移液枪稀释标准溶液，其容量允差为±1.0 μL，按矩形分布由此引入的相对不确定为稀释过程中温度对体积的变化引入的相对不确定度urel（T2）=0.002 035。容量瓶和移液枪各使用3 次，故标准溶液稀释过程所引入的相对不确定度为：

由公式（1）、（2）、（5）、（6）合成爱德万甜标准溶液配制所引入的相对不确定度：

2.2.2 样品称量引入的相对不确定度

待测复合调味料样品使用万分之一天平进行称量，根据电子天平检定证书，其最大允许误差为±0.5 mg，按矩形分布考虑，其相对标准不确定为：

2.2.3 样品定容引入的相对不确定度

2.2.3.1 25 mL 容量瓶引入的不确定度

复合调味料样品溶液定容所使用的25 mL A 级容量瓶20 ℃时的容量允差为±0.03 mL，按矩形分布考虑，包含因子属B 类评定，则：

2.2.3.2 温度影响溶液体积引入的不确定度

根据2.2.1 中所述，使用25 mL 容量瓶定容时体积的变化为：

按矩形分布考虑，则由体积变化引入的不确定度为：

由公式（9）、（10）合成样品定容体积引入的相对标准不确定度：

2.2.4 测量重复性引入的相对不确定度

重复测定复合调味料样品6 次，测得值分别为51.10、50.70、49.10、50.43、50.03、48.80 μg/kg，根据赛贝尔公式，单个测定值的标准偏差为：

由重复测定引入的相对不确定为：

式中：n 为样品测试次数；Xi为样品的测定值；X为重复测定n 次的平均值。

2.2.5 最小二乘法拟合引入的相对不确定度

配制爱德万甜的校准工作溶液，浓度分别为0.2、0.5、2.0、5.0、10、20 μg/L，用 UPLC-MS/MS 测得其相应峰面积为 16 170、37 137、153 55、362 099、737 041、1 450 435。采用最小二乘法进行拟合，得到直线方程y=72 498x+3 879.5，相关系数 r2=0.999 9。

按下列公式计算最小二乘法拟合引入的不确定度：

其中：Sr为峰面积测量的标准偏差：

式（13）、（14）中，Yi为标准曲线各浓度点对应的峰面积；Y 为标准曲线各浓度点带入至标准曲线中计算所得峰面积；b 为拟合曲线的斜率；P 为样品重复测定次数；n 为标准溶液质量浓度的个数；c0为样品测定的平均浓度，μg/L；（c 为标准曲线浓度的平均值，μg/L；ci为标准曲线各浓度的平均值，μg/L。

标准曲线拟合的相对不确定度为：

2.3 合成标准不确定度及扩展不确定度

由公式（7）、（8）、（11）、（12）、（15）得到本试验的合成相对标准不确定度为：

样品中爱德万甜的合成标准不确定度为：u（X）=0.029 7×50.03=1.49 μg/kg

扩展不确定度由合成标准不确定度乘以包含因子得到，取置信水平95%，则k=2，试样中爱德万甜的扩展不确定度为：

用UPLC-MS/MS 测定复合调味料中爱德万甜，当取样量为1.000 0 g，k=2（置信水平95%），理论添加水平为50.00 μg/kg 时，测得复合调味料中爱德万甜为（50.03±2.98）μg/kg。

3 结论

本研究采用液相色谱-串联质谱法对复合调味料中的爱德万甜进行测定，建立了不确定度来源的数学模型。通过比较各分量不确定度的大小发现最小二乘法拟合和标准溶液配制是不确定度的主要来源，样品称量、样品定容、重复性测定所引入的不确定度相对较小。因此，在测定过程中，要严格按照规范操作、使用合格的检定器具、保证仪器处于最佳状态，尽可能减少干扰，以保证检测结果的准确性。