金鲳鱼骨明胶的提取工艺及性质研究

于淑池，赖卓慧

（海南热带海洋学院海南省海洋食品工程技术研究中心，海南三亚572022）

明胶来源于动物的骨、皮肤等结缔组织中的胶原蛋白，是胶原纤维经处理后，具有高结晶度的纤维晶体结构被破坏，其氢键断裂，螺旋结构被打开而得到的水解产物[1-2]。市售明胶主要是由陆栖动物的皮和骨骼制备而成[3]。由于明胶市场需求的扩大[4]，加之哺乳动物疾病频发，研究者[5-9]开始从水产品源提取明胶，鱼骨中蛋白含量达到30%，且主要为胶原蛋白，是获取明胶的良好原料[10]。金鲳鱼（golden pompano），学名卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus），地方名称黄腊鲳，金鲳，属硬骨鱼纲、鲈形目、鲳鲹属[11]，是我国南方沿海重要的海产经济鱼类之一[12]，从2005 年以来，金鲳鱼的加工制品产量逐步升高，比例占金鲳鱼总产量的50%～80%[13]。2016 年，我国金鲳鱼产量约为 15 万 t[14]，产业链逐步完善，产业价值巨大。随着金鲳鱼需求量的大量增加，加工过程中有大量鱼头、鱼骨等副产物产生，且基本都没有被开发利用[15]，这不仅造成了水产资源的浪费，还产生了一定的环境污染。廖伟等[16]利用酶法金鲳鱼鱼皮中提取胶原蛋白，但金鲳鱼骨明胶的提取工艺还未见报道。从金鲳鱼骨中提取明胶可以替代部分哺乳类明胶，同时减少了环境污染，使金鲳鱼加工下脚料变废为宝。

目前骨明胶的提取主要采用传统的浸灰工艺及现代生物酶法[17]。浸灰工艺提取的明胶，存在好胶率低、能耗大、耗水量大等诸多缺点[18]。生物酶法工艺制得的明胶具有质量高、生产周期短、废水量低等优势，成为骨胶和皮胶工业的发展方向[19]。酶法提取明胶所用到的蛋白酶有木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶等，不同的蛋白酶作用位点不一样。木瓜蛋白酶作用于肽键而催化蛋白质水解, 同时具有较高的遇热稳定性[20]，因此本研究采用木瓜蛋白酶酶解金鲳鱼加工下脚料中的鱼骨，提取骨明胶，并对提取的明胶产品的相关性能进行测定，研究结果可以为金鲳鱼鱼骨等下脚料的合理利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

金鲳鱼：三亚市胜利广场旺豪超市；木瓜蛋白酶（食品级，初始酶活20 万U/g）：河南三化生物科技有限公司：色拉大豆油（食品级）：广州市金晨油脂有限公司；石油醚（60 ℃～90 ℃）、95%乙醇、36%冰乙酸、氢氧化钠（分析纯）、十二烷基硫酸钠（化学纯）：西陇科学股份有限公司；乙酸镁（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；硫酸铜、硫酸钾（分析纯）：成都金山化学试剂有限公司。

1.2 试验仪器

超级恒温水浴槽（HWS-26）：金坛市盛蓝仪器制造有限公司；质构仪（TMS-Pro）：美国Food Technology Corporantion 公司；电热套（PTHW）：巩义市予华仪器责任有限公司；旋转黏度计（NDJ-8S）：上海平轩科学仪器有限公司；旋转蒸发器（RE-52）：上海亚荣生化仪器厂；循环水式多用真空泵（SHB-B95）：郑州长城贸有限公司；电子天平（ME204E/02）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；精密可编程热风循环烘箱（LTDBX120F）：立德泰勀（上海）科学仪器有限公司；高速分散器（XHF-DY）：宁波新芝生物股份有限公司；pH计（PB-10）：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；多功能粉碎机（RS-FS1401）：合肥荣事达小家电有限公司；马弗炉（HLX-12B）：洛阳恒立窑炉有限公司；真空冷冻干燥机（Pilot-12E）：北京博医康实验仪器有限公司；紫外可见分光光度计（TV-1900 双光束）：北京普析通用仪器有限责任公司；傅立叶红外光谱仪（Nicoletnexos 型）：美国 Nicolet 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 金鲳鱼骨明胶的提取工艺流程

金鲳鱼→预处理（去内脏、皮、肉）→鱼骨清洗→烘干打粉→石油醚脱脂→木瓜蛋白酶酶解→高温灭酶→水浴提取→真空抽滤浓缩→冷冻干燥→明胶成品

操作要点：金鲳鱼洗净，沿鱼尾剖至鱼头，将鱼肉连同鱼皮切出，去掉内脏及鱼骨上的碎肉，反复用自来水清洗至鱼骨无杂质。60 ℃烘箱中干燥至鱼骨无水，打粉，鱼骨粉在石油醚作用下回流6 h～8 h 充分脱脂。称取（3±0.01）g 脱脂鱼骨粉放至锥形瓶中，按着1 ∶6（g/mL）的比例加入蒸馏水，采用木瓜蛋白酶在一定温度、pH 值下对脱脂鱼骨粉酶解一定时间，99 ℃的高温下条件下对木瓜蛋白酶进行灭酶20 min[7]，灭酶结束后放在水浴锅中设置65 ℃水浴加热3 h 提取明胶。进行抽滤，滤过液在60 ℃、真空度高于6.666×105Pa条件下浓缩到20%[8]。置于-40 ℃的条件下预先的冷冻12 个h，在10 Pa 压力下的真空冷冻干燥8 h[21]，得到金鲳鱼骨明胶成品。

1.3.2 金鲳鱼骨基本成本测定

对经过预处理的金鲳鱼骨的水分、粗脂肪、粗蛋白、灰分这4 个基本成分进行测定，其中水分按照GB 5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》[22]中的直接干燥法、粗脂肪按照GB 5009.6-2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》[23]中的索氏抽提法、粗蛋白按照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[24]中的凯氏定氮法、灰分按照GB 5009.4-2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》[25]中的方法，各平行3 次测定，结果取平均值。

1.3.3 金鲳鱼骨明胶提取的单因素试验

选择酶添加量、酶解温度、酶解时间、酶解pH 值4个因素，以明胶提取率为评定指标，进行单因素试验，确定最佳工艺条件。明胶提取率的计算公式为：

式中：m1为干燥明胶成品，g；m2为脱脂金鲳鱼骨粉，g。

1.3.4 金鲳鱼骨明胶提取的正交试验

在单因素试验的基础上，展开L9（34）正交试验，设计见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Levels and factors in orthogonal test

1.3.5 金鲳鱼骨明胶性质测定

1.3.5.1 凝胶强度测定

称取在最佳工艺条件下制得的金鲳鱼骨明胶，配成浓度为6.67%的明胶溶液，在7 ℃冰箱中进行凝冻（17±1）h 之后取出，快速用TMS-Pro 质构仪测定其凝胶强度，采用直径3 mm 圆柱形探头，设置压缩速度为60 mm/min，穿刺距离为4 mm，当质构仪的探头下压至4 mm，凝胶对探头的反作用力（g）能够达到最大值，这个最大反作用力也就是凝胶强度（g）[26]。

1.3.5.2 黏度测定

将6.67%的金鲳鱼骨明胶溶液，置于7 ℃冰箱中凝冻（17±1）h 后取出，在 60 ℃水浴锅中保持 1 h，旋动黏度计底座的螺钉，让黏度计顶部的水平泡保持在中间，把处理好的金鲳鱼骨明胶溶液放到NDJ-8S 型数字黏度计转盘底下，拧开万向接头的保护帽，选用1 号转子逆时针旋入黏度计万向接头上，设置黏度计的转速为30 r/min，之后调整转子高度，能够将转子的页面标志刚好处于明胶溶液的页面上之后，便启动黏度计转子旋转平衡，等读数显示稳定后方可读取数值，单位为 mPa·s。

1.3.5.3 透过率的测定

配制6.67%的金鲳鱼骨明胶溶液，并放在48 ℃的水浴锅中恒温至48 ℃，之后在45 ℃下利用分光光度计，以蒸馏水为基准校准仪器，测定450、620 nm 波长下明胶溶液的透过率（%）。

1.3.5.4 起泡性质测定

参照王珊珊等[27]的方法，测定金鲳鱼骨明胶样品（10、20、30 mg/mL）的起泡性以及起泡稳定性。量取适量体积（V0）的金鲳鱼骨明胶溶液放在50 mL 烧杯中，在转速为13 000 r/min 时间为2 min 的高速分散器的作用下，让金鲳鱼骨明胶溶液均质起泡，随后立即测定均质后的总体积V1，静置了40 min 后，再记下总体积V2。明胶的起泡性根据泡沫膨胀率来表示，泡沫膨胀率和泡沫稳定性计算公式如下：

1.3.5.5 乳化性质测定

参照王珊珊等[27]的方法，测定金鲳鱼骨明胶样品（10、20、30 mg/mL）的乳化性以及乳化稳定性。计算公式分别为：

式中：A0为金鲳鱼明胶乳化液在0 min 时的吸光度；A10为金鲳鱼骨为乳化液在10 min 后的吸光度；L 为比色皿的光径，0.01 m；N 为稀释系数，100；C 为蛋白质的浓度，g/m2；φ 为分散相体积分数，0.25；Δt 为10 min。

1.4 紫外光谱和红外光谱扫描分析

具体操作参照王珊珊等[28]的测定方法。

1.5 数据分析与处理

采用Oringin8.5 软件进行数据处理后并作图分析，其中数据则以平均值标准差的形式来表示。

2 结果与分析

2.1 金鲳鱼骨基本成分分析

金鲳鱼骨的基本组成成分测定结果见表2。

表2 金鲳鱼骨的基本组成成分Table 2 General composition of the bone of golden pompano

表2 显示，金鲳鱼鱼骨中的水分含量为（49.51±0.78）%，粗脂肪含量为（43.75±0.28）%，粗蛋白含量为（9.74±0.27）%，灰分含量为（8.80±0.19）%。由此可知金鲳鱼骨的脂肪含量相对高。提取明胶的原料若有脂肪的存在，明胶会因脂肪在常温下发生氧化酸败而产生异味、影响明胶的透明度，同时脂肪也会包裹在胶原纤维的周围而造成提胶的困难。因此在提取明胶之前需要对鱼骨进行脱脂，以保证鱼骨明胶的品质。

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 木瓜蛋白酶添加量对明胶提取率的影响

预试验研究发现，在木瓜蛋白酶添加量为4.5%时，明胶成品已经出现焦黄色，正常的明胶成品颜色是淡黄色至黄色[29]，因此进一步试验选择酶的添加量最大不超过4.5%。不同比例木瓜蛋白酶添加量对明胶提取率的影响结果见图1。

图1 木瓜蛋白酶添加量对明胶提取率的影响Fig.1 Effect of papain addition on gelatin extraction rate

图1 显示，明胶的提取率随着木瓜蛋白酶添加量的增加而呈持续增大的趋势。这是由于胶原蛋白分子比较紧密，木瓜蛋白酶能够除去胶原分子间的末端肽，初步破坏胶原蛋白的三维螺旋结构，使胶原分子获得分散的可能，逐步提高酶的浓度有助于促进酶解反应的进行，从而增大明胶的提取率[7]。同时考虑到在酶添加量为3.5%～4.5%时明胶提取率曲线上升趋势相对平缓，从节约成本的角度考虑，提取明胶的最佳酶添加量确定为3.5%。

2.2.2 酶解温度对明胶提取率的影响

木瓜蛋白酶不同酶解温度对金鲳鱼骨明胶提取率影响结果见图2。

图2 酶解温度对明胶提取率的影响Fig.2 Effect of enzymolysis temperature on extraction rate of gelatin

由图2 可以看到，随着温度（45 ℃～50 ℃）的升高，明胶提取率先升高，但继续升高温度（50 ℃～65 ℃）明胶提取率逐渐下降，这是因为随着温度的升高，使酶的活力渐渐增强，在50 ℃前酶活力较小，便于控制，但在50 ℃之后先随着温度的升高，酶活力逐渐增大。胶原蛋白被酶解过快，酶解程度过大，不易控制，胶原蛋白生成小分子物质，使明胶提取率降低。所以提取金鲳鱼骨明胶的最佳温度为50 ℃。

2.2.3 酶解时间对明胶提取率的影响

不同酶解时间对金鲳鱼骨明胶提取率的影响结果见图3。

图3 酶解时间对明胶提取率的影响Fig.3 Effect of enzymolysis time on gelatin extraction rate

图3 显示，明胶提取率在0.5 h～1.5 h 这时间范围内是逐步增大的，但在1.5 h 之后明胶提取率逐渐减少。这是因为在1.5 h 之前，酶作用于胶原的三股螺旋结构，使胶原降解，但在1.5 h 之后酶作用时间过长，胶原蛋白分子降解过度，生成了小分子物质，使得明胶提取率下降。因此提取金鲳鱼骨明胶的最佳酶解时间为1.5 h。

2.2.4 酶解pH 值对明胶提取率的影响

不同酶解pH 值对金鲳鱼骨明胶提取率的影响结果见图4。

图4 酶解pH 值对明胶提取率的影响Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis pH on extraction rate of gelatin

图4 显示，明胶提取率随着酶解pH 值的逐渐增大先增大后减少。pH6.0 前明胶提取率慢慢升高，pH值为6.0 时达到最高，之后逐渐下降。适宜的pH 值能够让酶充分发挥作用，但pH 值的升高会使酶失活或部分失活，酶也因而无法降解胶原蛋白分子而使明胶提取率下降，因而提取金鲳鱼骨明胶的最佳酶解pH值为6.0。

2.3 正交试验的结果与分析

金鲳鱼骨明胶提取的正交试验的结果见表3。

表3 正交试验极差分析结果可知，影响金鲳鱼骨明胶提取率的各因素主次关系为：A＞C＞D＞B，即酶添加量＞酶解时间＞酶解pH 值＞酶解温度。酶添加量对金鲳鱼骨明胶的影响最突出，其他因素影响相对较小。并由k 值可以得出，金鲳鱼骨明胶提取的最佳工艺条件为A3B1C2D3，金鲳鱼骨明胶的最佳提取条件为：酶添加量4.0%、酶解温度45 ℃、酶解时间1.5 h、酶解pH 6.5，并经由验证试验得到明胶提取率为21.87%。同高倩倩[6]用硫酸从鲤鱼骨提取明胶的提取率87.1%以及王珊珊等[28]用盐酸从真鳕鱼骨提取明胶的明胶提取率98.02%相比，本次试验提取的金鲳鱼骨明胶提取率是比较低的，但略大于孔丽丽等[8]胃蛋白酶酶解鲢鱼骨提取明胶的提取率19.16%。传统的酸碱法提取明胶产率相对较高，生物酶解法提取明胶，条件相对温和，产率略低，但具有环境友好性。

表3 L9（34）正交试验结果Table 3 The results of L9（34）orthogonal experiment

2.4 金鲳鱼骨明胶的性质测定

2.4.1 凝胶强度、黏度、透过率分析

对金鲳鱼骨明胶的凝胶强度、黏度及透过率进行测定，测定结果同国家标准GB 6783-2013《食品安全国家标准食品添加剂明胶》[29]的规定值进行对比，结果见表4。

表4 金鲳鱼骨明胶的凝胶强度、黏度及透过率Table 4 Gel strength，viscosity and transmittance of golden pompano bone gelatin

由表4 中可以看出，金鲳鱼骨明胶凝胶强度为（154.8±3.8）g，远远高于国标中规定的凝胶强度（50 g），同时也高于鲢鱼骨明胶[8]的凝胶强度（144.5 g），研究[30]表明，不同来源的的明胶凝胶强度大体可分为低值（＜150）、中等（150～220）、较高（＞220），本研究所得的明胶凝胶强度在此范围是属于中等水平。

金鲳鱼骨明胶黏度值为（2.0±0.43）mPa·s，国标中没有明确规定明胶黏度值，稍低于孔丽丽[8]鲢鱼骨明胶的黏度值4.36 mPa·s，说明金鲳鱼骨明胶多肽链相对较短。

在 450 nm 波长下的透过率为（32±0.12）%，在620 nm 波长下的透过率（73±0.49）%，在两个波长下的金鲳鱼骨明胶的透过率均是比高于国标[29]中的透过率，说明金鲳鱼骨明胶成品具有较好的透明度。

2.4.2 起泡性、乳化性质分析

金鲳鱼骨明胶的起泡、乳化性质结果见表5。

如表5 所示，明胶的起泡性和起泡稳定性是随着明胶浓度的的增加而升高，明胶在快速搅打的条件下能够形成起泡体，而起泡体的质构主要受到明胶含量和搅打得到的密度的影响。明胶浓度越高，明胶分子的疏水区域、黏度增大，促使明胶分子在快速搅打的过程中能够快速的富集于气液界面，形成紧密结合的多层膜。使明胶的起泡性和起泡稳定性增强[31]，所以明胶可作发泡剂应用于软糖、棉花糖中。

表5 金鲳鱼骨明胶的起泡性、乳化性测定结果Table 5 Foamability and emulsifiability of gelatin from golden pompano bone

表5 中明胶的乳化性因明胶浓度的增加而逐渐增强，而乳化稳定性却先上升后下降了，可能是因为随着明胶浓度增大，再增加蛋白质分子的数量，蛋白质分子在油-水液面吸附，形成的界面膜的强度和厚度不再增大反而减少。

2.4.3 紫外光谱分析

金鲳鱼骨明胶和食用明胶对比，测定其紫外吸收光谱，结果见图5。

图5 金鲳鱼骨明胶紫外光谱图Fig.5 Ultraviolet spectrum of gelatin from golden pompano bone

如图5 所示，金鲳鱼骨明胶在228 nm 处出现吸收高峰，而食用明胶吸收高峰在230 nm 处，与金文刚等[30]的大鲵皮明胶最大吸收峰234 nm 及高倩倩[6]的鲤鱼骨明胶最大紫外吸收峰235 nm 相接近，由此可以看出金鲳鱼骨明胶的紫外光谱图符合明胶的紫外特征吸收峰。但是金鲳鱼骨明胶却在在270 nm～280 nm 波长范围内出现了一个小的吸收峰，可能是因为蛋白质中存在一些如苯丙氨酸、酪氨酸、等芳香族氨基酸残基，会使蛋白质分子在270 nm～280 nm 范围内存在紫外吸收峰。

2.4.4 红外光谱分析

红外光谱扫描分析可以显示明胶的二级结构的变化，一般明胶的红外光谱可以观察到酰胺A 带的N-H伸缩振动，其吸收峰一般出现在3 400 cm-1～3 440 cm-1；酰胺 B 是由= C－H 和－NH+3的不对称拉升引起；酰胺I 表示多肽骨架C=O 的伸缩振动，其吸收峰一般在1 636 cm-1～1 661 cm-1；酰胺 II 表示 N-H 弯曲振动和C-N 伸缩振动，其吸收峰在1 549 cm-1～1 558 cm-1；酰胺 III 代表 Gly 骨架和 Pro 侧链的 CH2摇摆振动[28，32]，其吸收峰在1 200 cm-1～1 300 cm-1。金鲳鱼骨明胶的红外光谱图见图6。

图6 金鲳鱼骨明胶的红外光谱图Fig.6 IR spectrum of gelatin from golden pompano bone

图6 显示，金鲳鱼骨明胶的酰胺A、B 及酰胺I、II、III 的吸收峰分别出现在：3 334.92 cm-1、2 931.80 cm-1、1 647.20 cm-1、1 558.48 cm-1、1 338.59 cm-1处，酰胺 B、酰胺I、II 符合常见频率范围，酰胺A 位置稍偏低，这可能由于N-H 基团与肽链侧基缔合形成氢键，导致对应的酰胺A 带吸收峰产生了蓝移有关[16]，酰胺Ⅲ与胶原蛋白的三螺旋结构的完整性有关[33]，本试验酰胺III吸收峰稍有偏高，说明木瓜蛋白酶酶解提取的明胶失去了三螺旋结构[34]。

3 结论

木瓜蛋白酶酶解金鲳鱼骨，提取金鲳鱼骨明胶的单因素试验的最佳条件为，酶添加量为3.5%，金鲳鱼骨明胶提取率为20.56%；酶解温度为50 ℃时骨明胶提取率为20.63%；酶解时间为1.5h 时骨明胶提取率为21.35%；酶解pH 值为6.0 时骨明胶提取率为19.08%。

正交试验确定出影响金鲳鱼骨明胶提取率的主次因素依次是：酶添加量、酶解时间、酶解pH 值、酶解温度。即金鲳鱼骨中提取明胶应以酶添加量4.0%、酶解时间1.5 h、酶解温度45 ℃、酶解pH6.5 为最佳工艺条件，金鲳鱼骨明胶提取率为21.87%。

对最佳工艺条件下提取的的金鲳鱼骨明胶的性质进行测定，测得金鲳鱼骨明胶的凝胶强度为（154.8±3.8）g，黏度为（2.0±0.43）mPa·s，450、620 nm 波长下的透过率分别为（32±0.12）%、（73±0.49）%，起泡性、起泡稳定性以及乳化性均随着明胶浓度的增加而增强，而乳化稳定性却随着明胶浓度的增加先增强后减弱。紫外光谱和红外光谱扫描均具有明胶的特征吸收峰。