文心兰类原球茎形态建成及电子传递蛋白和凯氏带蛋白基因的极性表达模式分析

王雪晶 李蓉 王姗姗 张婧 林玉玲 陈裕坤 林争春 陈青青 叶开温 赖钟雄 徐涵

摘  要：以文心兰‘柠檬绿（Oncidium hybridum ‘Honey Angel）为材料进行类原球茎发育过程的形态和结构观察，对其离体形态建成进行分析，并对类原球茎（protocorm-like body， PLB）分化过程中的顶部和基部组织以及组培苗的根、茎、叶中的凯氏带蛋白基因CASP和电子传递蛋白基因Fd（ferredoxin）、FNR（ferredoxin-NADP+ oxidoreductase）的表达模式进行分析。结果显示：类原球茎在分化过程中逐步建立了两极性。随着类原球茎的发育，自顶端向基部形成维管形成层，继而形成维管束;之后有叶原基产生并形成单子叶式茎尖结构和出现类原球茎胚轴的伸长，无胚根形成。类原球茎形成幼苗后植株基部有侧根的产生。实时荧光定量PCR结果表明：在根中高表达和在茎中高表达的CASP、FNR和Fd基因在类原球茎不同发育阶段和组织中存在极性的差异表达，参与了无胚根体细胞胚胎的生长发育过程。综上所述，文心兰体细胞胚在发育过程中从弱分化器官向茎叶器官转变，形成兰花特有的非同步体细胞胚胎发育现象——类原球茎。

关键词：文心兰;类原球茎;离体形态建成;体细胞胚胎发生

中图分类号：S682.31      文献标识码：A

Abstract： The morphology and structure of the protocorm-like body （PLB） of Oncidium hybridum ‘Honey Angel during development were observed and the PLB in vitro morphogenesis was analyzed. The expression patterns of CASP （Casparian strip membrane domain protein） and electron transfer genes Fd （ferredoxin） and FNR （ferredoxin-NADP + oxidoreductase） in PLBs， roots， stems， and leaves of in vitro cultured seedlings and PLB apical and basal tissues during the PLB differentiation were further analyzed. The results showed that the PLBs gradually established polarity during the differentiation in which a vascular bundle was formed from the PLB sub-apical area to the basal part. Later， a leaf primordium was generated and the monocotyledon shoot apical structure was formed. Root formation was in a lateral pattern and occurred after the PLB embryonic axis had significantly elongated. The basal tissue of the PLB did not develop any embryonic root. Lateral roots occurred in the seedling stage. It is concluded that the PLB development of O. hybridum is a type of asynchronous somatic embryogenesis， i，e， the embryonic root does not form during embryogenesis. Results of real-time quantitative PCR showed CASP， FNR and Fd genes showed differentially bipolar expressions in different developmental stages and tissues of PLBs， playing roles in the rootless PLBs morphogenesis. In summary， the somatic embryos of O. hybridum transform from weakly differentiated organs to shoot-like organs during development， forming an orchid-specific somatic embryogenic phenomenon， PLB.

Keywords： Oncidium hybridum; protocorm-like bodies; in vitro morphogenesis; somatic embryogenesis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.12.004

文心蘭（Oncidium hybridum）为兰科（Orchidaceae）文心兰属（Oncidium）具有较高观赏价值的花卉[1-2]。但由于分株繁殖系数较低，目前主要利用组织培养技术对兰花开展工厂化种苗生产[3]。文心兰类原球茎的形成是兰花离体培养过程中特有的发育现象，通过PLB的诱导和增殖可以在短时间内实现兰花试管苗的大量繁殖[4]。原球茎是兰科植物种子萌发产生的一种特殊结构，进一步发育成为完整植株[5]。类原球茎（protocorm-like bodies，PLBs）又称拟原球茎，是用来描述兰科植物组培过程中产生的类似种子中合子胚的结构。Morel在1960年进行虎头兰（Cymbidium hookerianum）茎尖培养时发现外植体上能够形成类似原球茎的组织，将其命名为类原球茎。类原球茎可由植株的腋芽[6]、叶[7]、茎尖[8]、愈伤组织[9]等部位诱导产生。原球茎和类原球茎在植物学领域是一个研究的模式结构。大部分的胚和植株都具有根或根状结构，以完成植物对土壤中养分的吸收。而兰科植物的合子胚（又称原球茎）和体细胞胚（又称为类原球茎）不具有根或根状结构，其根的出现要晚于茎端分生组织的分化。这是兰科植物胚胎发生区别于其他被子植物的一个重要特点。其胚胎发生的极性在没有根的参与下，如何建立，以及如何完成胚胎的分化和发育，迄今知之甚少。

铁氧还蛋白（ferredoxin， Fd）和铁氧还蛋白氧化还原酶（ferredoxin-NADP+ oxidoreductase， FNR）是高等植物中广泛存在的电子传递蛋白，广泛参与植物细胞的生理生化过程。Fd普遍存在于细菌、藻类及高等植物中[10]，参与NADP的再生、卡尔文循环以及细胞内ROS平衡的调控，此外，它还是亚硝酸盐还原酶、谷氨酸合成酶以及脂肪酸去饱和酶等生物酶类的直接电子供体[11]。在文心兰LFNR和RFNR的研究中表明FNR基因具有组织表达特异性，LFNR更多地在叶中表达，而RFNR则更多地在根中表达[12]。

根是植物吸收水分和养分的重要器官，对植物的生长发育起着至关重要的作用[13]。根的初生结构由外至内可分为表皮、皮层和维管柱3个部分。凯氏带位于根的内皮层细胞，在细胞的上、下壁和径向壁上，有木质化和栓质化的加厚，呈带状环绕细胞1周[14]。凯氏带能够调节离子的质外体吸收途径，对离子的径向运输起阻滞作用，实现离子的选择性吸收，同时凯氏带还能够阻止有毒物质的吸收和病原菌的入侵[15]。在被子植物中，凯氏带主要存在于根的内、外皮层，大部分植物茎和叶中的内皮层中不存在凯氏带[16]，但是，在豌豆黄化苗的茎中和天竺葵茎中木栓化细胞中发现有凯氏带结构[17-18]，叶片内皮层凯氏带加厚存在于一些草本植物中[19-20]。在蕨类植物叶的内皮层中普遍存在凯氏带[16]，在部分华山松、白皮松等松杉类植物的叶内皮层中也具有凯氏带[21-22]。凯氏带与植物根的生长密切相关，凯氏带蛋白（casparian strip membrane domain proteins， CASPs）被发现是特异性出现在凯氏带形成区域的膜蛋白，它定位在凯氏带形成的位置上[23]，但也没有证据表明已发现的CASPs一定都不出现在其他部位。凯氏带蛋白的差异表达分布模式分析，不仅可以揭示CASP的功能，而且可以进而对文心兰类原球茎根的发育分子机制进行探索。目前，关于文心兰类原球茎形态建成及极性建立的研究相对较少，其属于器官发生途径还是体细胞胚胎发生途径迄今尚无定论。本试验对类原球茎发生过程的形态学和细胞学特征进行研究，以及凯氏带蛋白CASP和电子传递蛋白FNR、Fd基因在文心兰类原球茎发育过程中的表达进行分析，为文心兰类原球茎发生机理研究和形态调控提供参考。

1  材料与方法

1.1  材料

以‘柠檬绿文心兰为材料，由福建农林大学园艺植物生物工程研究所提供。取样均3次重复，将所取样品迅速放入液氮速冻后于?80 ℃冰箱保存备用。

1.2  方法

1.2.1  文心兰形态及细胞结构观察  在文心兰类原球茎组织培养中，将类原球茎用刀切成均等的小块，接种于MS+蛋白胨1 g/L+土豆汁65 g/L+活性炭1 g/L+蔗糖20 g/L+琼脂10 g/L培养基上进行培养，培养基pH为5.4，121 ℃高压灭菌，培养条件为25 ℃，光照時间12 h/d。在表面会产生新的类原球茎，培养过程中进行连续观察并取样。取不同发育时期的材料，进行徒手切片的制作与观察。

1.2.2  总RNA的提取及cDNA的合成  总RNA的提取按不同发育阶段和组织区域进行取样：组培苗的根、茎、叶（图1A）;球形期类原球茎（图1B）;茎尖形成阶段的类原球茎（分化1，图1C）;茎尖形成并伸长阶段的类原球茎（分化2，图1E）。

为研究茎尖和基本根的分化，在分化1阶段中类原球茎上半部（分化1-上）和基部（分化1-下，图1D），以及在分化2阶段中类原球茎上半部（分化2-上）和基部（分化2-下，图1F）的组织也进行分别的RNA提取。

参考Trizol（Invitroigen 公司）试剂盒的说明书提取样品的总RNA，并用Thermo超微量核酸检测仪测定RNA浓度，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度，用SYBR ExScriptTM（TaKaRa）试剂盒逆转录成cDNA用于实时荧光定量PCR分析 。

1.2.3  文心兰电子传递蛋白Fd和FNR基因及凯氏带蛋白CASP基因的筛选  本实验室在文心兰转录组中筛选并克隆了7条Fd基因和2条FNR基因。Fd基因分别为Unigene0000898、Unigene0012213、Unigene0012214、Unigene0013930、Unigene0016888、Unigene0020807、Unigene0038950[12]。FNR基因分为RFNR基因和LFNR基因。拟南芥网站下载获得拟南芥CASP基因，pfam分析该家族基因具有DUF588结构域（PF04535）。在文心兰转录组中筛选具有该结构域的基因，共获得Unigene0017749、Unigene0017008、Unigene0005831、Unigene0005699、Unigen004691、Unigene002015、Unigene0019739、Unigen0006936、Unigene0014311、Unigene0006200、Unigene0019942、Unigene0017335、Unigene0017864和Unigene0018359这14条基因。

1.2.4  CASP基因及FNR和Fd基因表达特性分析  运用罗氏LightCycler 480仪器，通过qPCR检测CASP基因及FNR和Fd基因在文心兰不同组织部位的表达情况。根据实时荧光定量PCR引物设计原则，设计CASP基因及FNR和Fd基因的qPCR引物（表1、表2），以及内参基因Actin的特异性引物Actin-Q-F和Actin-Q-R（表1）。采用SYBR premix Ex TaqTM Ⅱ kit（TaKaRa）进行qPCR反应，反应体系为20 μL： SYBRⅡ酶10 μL，ddH2O 7.4 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.8 μL。反应条件为：95 ℃预变性30 s;95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，45次循环。数据分析采用2?CT法获得CASP基因及FNR和Fd 基因的相对表达量，采用SPSS 19.0对CASP基因及FNR和Fd 基因的表达分别进行差异显著性分析，用ORIGIN 8.5进行绘图。

为研究文心兰Fd基因在植物进化过程中的保守性以及分类情况，选取拟南芥、水稻、玉米、菠萝以及蝴蝶兰5个物种的Fd基因编码的氨基酸序列与文心兰Fd基因编码的氨基酸进行聚类分析，该基因家族可分为线粒体型和叶绿体型两大类，其中叶绿体型的铁氧还蛋白基因可分为FdC2、FdC1、Fds 3个亚支，Fds在植物铁氧还蛋白基因中占据较大比例（图6），且文心兰Fd 基因在进化过程中与同为兰科植物的蝴蝶兰保持较近的亲缘关系，进一步说明了Fd在植物中的保守性和普遍性[27]。

基本理化性质分析表明，除Unigene0013930为碱性蛋白，其余均为酸性蛋白，除Unigene0012213和Unigene0020807为稳定蛋白，其余均为不稳定蛋白，文心兰Fd家族成员均无信号肽，均不形成螺旋卷曲螺旋结，Unigene0016888、Unigene0020807、Unigene0038950均有2个跨膜螺旋结构，只有Unigene0000898定位于线粒体，其余均定位于叶绿体。

2.5  文心兰CASP基因生物信息学分析

保守功能域分析结果表明CASP基因属于MAEVEL超家族，包含DUF588结构域。对14个CASP基因序列生物信息学分析发现（表3），CASP蛋白序列的长度在179～331 aa之间，预测蛋白相对分子量（Mr）在19 117.23～36 824.78之间，等电点在5.04～10.17之间。根据预测的理论等电点发现有3个CASP蛋白为碱性蛋白，其余9个均为酸性蛋白;蛋白不稳定系数7个大于40，表明有7个CASP基因属于不稳定蛋白，其余7个为稳定蛋白;平均亲水系数2个为负值，表明有2个CASP蛋白是亲水蛋白。二级结构分析发现，CASP蛋白中无规则卷曲所占的比例最大。

为研究文心兰CASP在植物进化过程中的保守性，选取拟南芥、水稻、玉米、菠萝和铁皮石斛5个物种的CASP基因编码的氨基酸序列与文心兰CASP基因编码的氨基酸序列进行聚类分析，图7表明文心兰CASP基因在进化过程中与铁皮石斛和菠萝有较近的亲缘关系。

2.6  文心兰FNR和Fd基因在类原球茎分化过程中的表达分析

为研究类原球茎形态发生，总RNA根据发育阶段和不同组织部位进行取样如图1所示。分析FNR和Fd基因在文心兰类原球茎分化过程中及分化2个阶段的顶部和基部组织的基因表达情况（图8、图9）。RFNR和LFNR在文心兰分化的根、茎、叶、类原球茎及类原球茎分化的2个阶段及分化2个阶段的顶部和基部均有表达。RFNR在根中表达量是LFNR的2倍，RFNR在类原球茎中的表达量是LFNR的2.4倍。RFNR在文心兰根、类原球茎、分化1阶段、分化1阶段的基部、分化2阶段的基部表达量均高于LFNR的表达量。LFNR在叶、分化2、分化2的顶部表达量高于RFNR的表达量。在分化1阶段的顶部RFNR和LFNR的表达量基本相同，因为此时类原球茎刚开始分化，顶部所占比例较少，因此二者表达量相当。

Fd基因在文心兰类原球茎分化过程中及分化2个阶段的顶部和基部组织的基因表达情况，结果见图9。Unigene0000898和Unigene0020807在文心兰根中的表达量高于茎和叶，在类原球茎中的表达量相比其他基因要高，在分化2的表达量高于分化1的表达量，在分化1-上、分化1-下、分化2-上和分化2-下中的表达量相差不多，其在类原球茎发育过程中可能主要在根的分化中起主要作用。Unigene0013930、Unigene0016888、Unigene0012213、Unigene0012214、Unigene0038950和Unigene0012214在茎、叶、分化2、分化1-上、分化2-上表达量高于其他组织部位，其在类原球茎发育过程中可能主要在茎叶的分化中起主要作用。

2.7  文心兰CASP基因在类原球茎分化过程中的表达分析

CASP在文心兰类原球茎分化过程中及分化2个阶段的顶部和基部组织的基因表达情况见图10。Unigene0017335、Unigene0005699、Unigene0019739、Unigene0006936、Unigene0019942、Unigene0017864具有相似的表達模式，在根中的表达量高于茎和叶中的表达量;类原球茎及分化1和分化2表达量相当，分化1-上表达量略高于分化1-下，分化2-上表达量略高于分化2-下。Unigene0017008、Unigene0005831在叶中表达量高于根和茎中的表达量，在类原球茎中表达量最高，分化1和分化2表达量相当，分化1-上比分化1-下表达量高，分化2-上比分化2-下表达量高;Unigene004691、Unigene0017749、Unigene002015和Unigene0018359在叶中表达量高于根和茎中的表达量，在分化1表达量远高于分化2，同时分化1-上和分化1-下的表达量高于分化2-上和分化2-下;Unigene0014311和Unigene0006200在不同组织部位中表达量呈本底表达。

2.8  文心兰类原球茎离体形态建成中极性和组织分化的量化分析

根据荧光定量PCR结果表明，归类出根和茎叶中各基因成员的最高表达量分别是422和342，将相同基因成员在类原球茎中及各阶段和组织中的表达量数据（图8～图10）进行量化比对，可以量化地计算出一个发育时期和各组织区域中根和茎叶中的表达量，从而定位其在坐标中的位置，显示出其极性和组织分化的程度（图11、图12）。从PLB整体发育方面分析（图11），球形期PLB接近根和茎的表达量中间，没有明显的极性。在PLB分化出茎尖时（分化-1），PLB向茎的方向分化，而根的方向减弱。在PLB分化出芽并伸长时（分化-2），根的分化加强，而茎的分化减弱。进一步研究发现（图12），在PLB分化-1阶段，PLB 上下两部分组织也都偏向茎的方向分化;而在分化-2阶段，PLB上部组织也保持向茎的方向分化，下部则向根的方向分化。因此，从基因差异表达的分析结果看，PLB产生胚根的极性生长力脆弱。

3  討论

3.1  文心兰类原球茎的形态建成是没有根的同步发生的体细胞胚胎发生

兰科植物种子胚发育不全。在种子萌发过程中，种胚发育成原球茎，原球茎不断发育，形成分生组织和薄壁细胞，分生区形成芽体，芽体由带有茎尖的伸长的茎，但没有根的形成，最后由侧根的发生形成完整植株[28]。本研究通过观察文心兰类原球茎的形态建成，发现类原球茎的发育过程与兰科植物种子胚发育过程相似。类原球茎从愈伤组织产生，形成只有原表皮和内部细胞形成的球形胚，之后上下两端建立极性。类原球茎基部出现离散分布的假根毛，推测与根毛的功能相似[29-30]。类原球茎的中心部分靠上部的顶端形成有纵向伸长的形成层，在较成熟的区域形成维管束，维管束与叶原基相连。至此，虽然显示出纵向的两极分化，但没有根的产生，形成类原球茎型的茎叶结构的幼苗。这在其他兰科植物中也普遍存在[31-32]。因此，文心兰类原球茎的形态建成是一种根不同步发生的非同步体细胞胚胎发生类型。

3.2  基因特异性的差异表达可以定量地衡量文心兰类原球茎的形态发生极性和程度

FNR和Fd是植物能量代谢的末端电子传递蛋白和电子供体[11， 33]。CASPs与根的凯氏带形成具有特异相关性[23]。在本研究中，FNR和Fd基因及CASP基因在文心兰不同发育时期和不同组织中的差异表达，显示了文心兰类原球茎的组织分化。

在水稻的研究中，OsCASP1在水稻的根中表达量最高;OsCASP1在水稻抽穗期的各个组织器官中均有表达，但在根中表达量高于其他组织器官，水稻根中CASP基因在根系选择性吸收矿质元素特别是对Ca和Si的吸收起着重要作用[34]。根在植物生长中扮演重要角色，从土壤中吸收养分供植物生长，CASP主要存在于维管植物的根内皮层细胞中[23]。在拟南芥中，CASP在多种细胞类型中特异性表达[35]。其他的植物，尤其是单子叶植物，与拟南芥差异较大。其凯氏带的形成和相关基因，也常会表现出其所在植物特有的结构和功能[36]。

为分析根的极性分化，本研究根据Fd、根型RFNR与叶型LFNR及CASP基因在根和茎端的差异性表达和在不同发育阶段的极值计算，在分子水平揭示了电子载体类看家基因和凯氏带相关的根的特异性基因都在类原球茎发育过程中处于茎叶的分化方向而不是根的分化方向;至发育后期，两极分化才出现根的分化偏向（图11、图12）。

综上所述，文心兰体细胞胚在发育过程中从弱分化器官向茎叶器官转变，形成兰花特有体细胞胚胎发育现象——类原球茎。文心兰类原球茎的形态建成是根不同步发生的非同步体细胞胚胎发生类型，直到类原球茎形成幼苗后才有侧根的产生。虽然在类原球茎形态建成过程中并没有根的产生，但是形态上有假根毛，结构上有维管束贯穿茎叶和基部，从基因表达谱上不出现根的空白表达。因此，推测类原球茎的基部具有部分根的功能。类原球茎在生长发育过程中组织分化和形态建成伴随着基因的差异表达，显示出定量的极性和分化偏向性。

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