肝硬化患者经颈静脉肝内门体分流术前后肠道菌群特征分析

李 强， 朱清亮， 张海龙， 邓明明， 胡 庆， 王紫洁

西南医科大学附属医院 消化内科， 四川 泸州 646000

肝硬化作为一种主要的慢性肝脏疾病，具有高发病率和死亡率[1]。肝硬化患者易并发食管胃底静脉曲张破裂出血，治疗上常采用药物、内镜、经颈静脉肝内门体分流术(TIPS)等治疗手段[2]。研究[3-4]发现肝硬化患者的肠道菌群丰度及多样性降低，且自身肠道菌群与临床预后也具有相关性，主要为变形菌门中的肠杆菌科、弯曲菌科和巴斯德菌科，厚壁菌门中的肠球菌科和链球菌科[5]。近年来肝硬化患者TIPS后相关并发症降低[6-7]，而TIPS后的肠道菌群改变并不清楚。猜想肝硬化患者TIPS后肠道血运重建，肠道黏膜循环改善，对肠道菌群产生影响。因此，通过高通量测序方法分析肝硬化患者TIPS前后肠道菌群变化，揭示肝硬化患者肠道菌群特征。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2018年7月-2019年7月因肝硬化失代偿期门静脉高压伴食管胃底静脉曲张破裂出血或(和)难治性腹水、脾功能亢进于本院进行TIPS的18例患者。肝硬化诊断参考中华医学会消化病学分会制定的《临床诊疗指南-消化疾病分册》[8]，并根据病史、临床表现及辅助检查(CT及B超)确诊。排除标准：(1)入院时为危重患者、重症感染、最近1周大量使用过抗生素者；(2)老年患者(>75岁)，合并严重并发症(心、肺、肾等重要脏器)者；(3)既往存在原发胃肠道疾病、消化系统肿瘤、自身免疫性疾病者；(4)TIPS禁忌证者；(5)正在服用益生菌者。本研究方案经西南医科大学附属医院医学伦理委员会批准(批号：KY2019044)，所有参与者都收到了有关研究的信息并签署知情同意书。

1.2 研究方法 前期准备相关资料及采集粪便的耗材，于手术前(F0期)常规收集粪便(3 g)，并在术后1个月(F1期)、术后3个月(F3期)常规随访检查时同步收集患者的粪便，粪便采集选用标准采集器(深圳微科服科技有限公司提供)，将粪便分别保存于-80 ℃冰箱。同时收集患者术前及术后肝功能[ALT、AST、Alb、TBil、DBil、总胆汁酸(TBA)、GGT]和凝血检验结果[PT、部分凝血酶时间(APTT)、PTA、纤维蛋白原(FIB)]。随访患者18例，术前采集粪便18例，术后第1个月采集粪便6例，术后第3个月采集粪便9例。因患者门诊随访时采集粪便困难，部分患者没有在随访同时采集到粪便，部分患者也未能在3个时期同时采集粪便。

1.3 粪便微生物DNA提取、鉴定以及16S rRNA基因测序 实验共收集样本33例，根据E.Z.N.A.®soil试剂盒 (美国，Omega Bio-tek)说明书进行总DNA抽提，NanoDrop2000检测DNA浓度和纯度，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量；选用338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 引物对V3-V4可变区进行PCR扩增，2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (美国，Axygen Biosciences,) 纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测及QuantiFluorTM-ST (美国，Promega) 定量检测。根据Illumina MiSeq 平台 (美国，Illumina)将纯化后的扩增片段构建PE 2*300文库，采用Miseq PE300平台进行测序。

2 结果

2.1 患者基本情况 18例患者中男14例，女4例。各组TBil水平比较差异有统计学意义(F=8.201，P=0.001)；F3显著高于F1和F0，F1显著高于F0(P值均<0.05)。各组TBA水平比较差异有统计学意义(χ2=39.482，P<0.001)；F1和F3显著高于F0(P值均<0.05)(表1)。

表1 不同时间肝功能、凝血指标比较

注：与F0 比较，1)P<0.05；与F1 比较，2)P<0.05。

2.2 物种的组成分析 在研究的粪便样本中，包括术前F0期18例，F1期6例，F3期9例。相较于F0时期菌群组成，F1时期厚壁菌门增多，F3变形菌门增多，F1及F3时期放线菌门增加，而梭杆菌门减少，拟杆菌门变化不大(图1)。

注：图示检测结果中相对丰度最高的20个菌群种类,相对丰度较低的物种被归类其他。横坐标是分组名，纵坐标表示注释到该门水平的序列数目占总注释数据的比率。

图1各个分组在门水平上的相对分布情况

2.3 物种差异分析 对肝硬化患者3个时期粪便样本进行物种差异分析。不同时期菌群组成见表2。LEfSe差异判别分析方法(图2)显示在F0期表现的优势菌群有链球菌属及链球菌(P值均=0.041)、布雷德菌属(P=0.019)、罗氏菌属(P=0.027)、放线菌科及放线菌属(P值均=0.03)；在F1期表现的优势菌群有根瘤菌科(P=0.009)、雷尔氏菌属(P=0.02)、腐螺旋菌科及腐螺旋菌属(P值均=0.009)、SMB53(P=0.025)、Candidatus-Xiphinematobacter(P=0.009)、溶杆菌属(P=0.009)、奇丁属科(P=0.009)、沉积物杆菌属(P=0.009)、柄杆菌科及柄杆菌属(P值均=0.006)、创伤球菌属(P=0.009)、毛螺菌属(P=0.04)、罗斯式菌属(P=0.02)、瘤胃球菌属(P=0.043)、瘤胃菌科(P=0.01)；F3期表现的优势菌群有丁酸弧菌属(P=0.02)、鞘氨醇单胞菌属(P=0.003)、布劳特氏菌属(P=0.03)、粪球菌属(P=0.002)、芽殖菌属(P=0.002)。

2.4 样本Alpha多样性指数统计分析 Alpha多样性指数是对不同样品中物种多样性的分析。对所有样本进行Alpha分析(Chao1、Shannon、Simpson、Ace指数)，研究显示不同时期肠道菌群的物种多样性分析差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表3)。

表2不同时期菌群组成

门类F0(n=18)F1(n=6)F3(n=9)厚壁菌门链球菌属、链球菌、布雷德菌属罗斯氏菌属、瘤胃菌科、瘤胃球菌属、创伤球菌属、SMB53、毛螺菌属丁酸弧菌属、布劳特氏菌属、粪球菌属拟杆菌门奇丁属科、腐螺旋菌科、腐螺旋菌属、沉积物杆菌属芽殖菌属变形菌门柄杆菌科、柄杆菌属、雷尔氏菌属、 溶杆菌属、根瘤菌科鞘氨醇单胞菌属疣微菌门Candidatus-Xiphinematobacter放线菌门罗氏菌属、放线菌科、放线菌属

表3 不同时期Alpha指数比较

注：Chao1指数及Ace指数用于估计物种总数，代表物种丰富度；Shannon指数及Simpson指数代表物种多样性。

2.5 样本Beta多样性指数统计分析 Beta多样性分析是对不同样品间的微生物群落构成进行比较，采用近似F检验，结果显示F0 vs F1(F=2.603,P=0.02)、F0 vs F3(F=1.954,P=0.06)、F1 vs F3(F=0.420,P=0.87)中，仅F0 与 F1期菌群的多样性差异有统计学意义。

2.6 相关性热图分析 相关性热图分析用于分析临床指标与微生物群之间的相关性。收集患者术前的肝功能，血脂(HDL、LDL、TC、TG)，凝血指标，血常规(Hb、WBC、PLT)，门静脉压力(PVP)，肌酐(CR)等指标，绘制肠道菌群与术前检验指标的关系图，其中与TIPS密切相关的指标PVP在属水平与双歧杆菌属﹑柯林斯菌属﹑瘤胃球菌属具有负相关性(r值分别为-0.35、-0.38、-0.34，P值分别为0.04、0.02、0.04)，与牛肝菌属具有正相关性(r=0.41，P=0.015)，其他检验指标也与不同菌群亦存在相关性(P值均<0.05)(图3)。

3 讨论

近年来关于肝硬化与肠道菌群的研究较多，揭示了肝硬化患者肠道菌群变化[9-10]。目前有研究[11]显示肝硬化患者拟杆菌门丰度降低，厚壁菌门及变形菌门丰度增加。其中肝硬化患者肠肝菌科、产碱杆菌科、链球菌科、韦荣式菌科和梭杆菌科的比例增高，同时拟杆菌门、瘤胃菌科和毛螺菌科的数量减少[12]，这些菌群的变化提示肝硬化患者菌群在组成方面确实发生了变化。另外，在肝性脑病患者中，有较高比例的韦荣式菌科、产碱杆菌科、葡萄球菌科、肠球菌科、紫单胞菌科和乳杆菌科，变形菌门，这些菌群与认知水平低下相关[13-14]。在有益菌群方面，肝硬化患者欧白布拉提菌、粪肠杆菌、罗斯布里亚菌属和多雷氏菌属与减少炎症及改善认知有关[15]。因此，肝硬化患者肠道菌群变化或许揭示某种临床意义。目前TIPS作为失代偿期肝硬化治疗的一种手段，临床运用增多，但关于TIPS前后肠道菌群的变化并不清楚。

本研究发现，TIPS 3个时期指标中TBA、TBil存在统计学差异，考虑其可能与TIPS后肝脏门静脉灌注减少，支架损伤，支架压迫小胆管等相关。而在肠道菌群方面，TIPS后1个月肠道血运重建，肠道菌群发生明显改变，以拟杆菌门及变形菌门的菌属增多，菌群种类较TIPS前有所改善，但变形菌门的增多可能与肝性脑病相关，具体菌群的作用还需进行研究。同时，TIPS后3个时期菌群Alpha多样性变化无统计学差异，物种多样性在术后变化不大，这可能与观察的时间较短相关。但在Beta多样性中，菌群结构组成发生了变化。相较于F0期，F1期菌群组成增加，F3期相较于F0期无统计学差异(P=0.06)，可能与样本量的多少有关。最后通过相关性热图分析，发现TIPS前各临床指标与肠道菌群具有相关性，但能否通过调节肠道菌群改善人体各功能指标，以及具体的改善机制需要进一步研究。因此，肝硬化患者TIPS后肠道菌群短期内发生了改变，可能是TIPS影响了肠道菌群的改变。

肠道菌群与人体之间的相互作用是非常复杂的过程。但因肠道菌群种类繁多，功能不清，加之研究的样本量较少，随访时间短等影响因素较多，未来需要扩大样本量进一步探讨。