长链非编码RNA EXOC7在非酒精性脂肪性肝病中的表达及临床意义

张丽云， 邓家琦， 张 双， 邓华江， 李晓红

西南医科大学附属医院 a.健康管理中心； b.超声医学科； c.老年病科； d.神经外科， 四川 泸州 646000

脂肪肝是一种可逆性肝病，超重、肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病、慢性酒精中毒以及HBV和HCV感染都有可能诱发脂肪肝[1]。脂肪肝最终有可能发展为肝纤维化，并导致肝硬化和肝癌。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是病理变化与酒精性肝病相似但无过量饮酒史的临床综合征，好发于中年特别是超重肥胖个体，其发病率在西方国家非常高[2]。随着我国国民经济的快速发展以及物质生活水平的显著提高，高能量的膳食密度、不健康的生活方式越来越普遍，NAFLD也成为愈来愈重要的慢性肝病问题[3]。NAFLD作为一种与遗传-环境-代谢应激密切相关的疾病，以肝细胞内过量脂肪沉积为特征，并且常与肥胖、糖尿病、高血压、高脂血症等代谢性紊乱相伴，是一种从单纯的脂肪变性、无炎症或纤维化到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的一系列疾病[4]，其发病机制较为复杂，目前尚未完全阐明。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，其通过RNA聚合酶Ⅱ从基因位点转录，与mRNA相比，几乎没有已知的生化差异[5]。近年来研究[6]发现，lncRNA的异常调控与多种疾病的发生发展密切相关。此外，lncRNA在细胞中通过多种方式参与基因调控和蛋白质合成，进而影响细胞内物质代谢，参与NAFLD的发生发展[7]。课题组前期预实验发现，lncRNA外泌体复合物7(lncRNA exocyst complex component 7，lncRNA EXOC7)在NAFLD患者组织中高表达，提示lncRNA EXOC7可能与NAFLD的发生和发展有关。本研究应用实时荧光定量PCR法(Real-time PCR)检测lncRNA EXOC7在NAFLD患者肝组织及血液标本中的表达及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2013年1月1日-2018年12月31日在本院住院行肝穿刺并经影像学及组织病理学确诊为NAFLD的患者，诊断标准符合2012年美国NAFLD诊疗指南[8]。另选取同期于本院体检的无脂肪变性和脂肪性肝炎的其他肝病(主要包括轻型药物性肝损伤、慢性乙型肝炎)患者作为对照。本研究方案经由西南医科大学附属医院伦理委员会批准(批号：20121201)，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 观察指标 收集所有研究对象的病理穿刺组织标本，并于诊断明确后次日清晨空腹采集静脉血5 ml，静置2～4 h，2500～3000 r/min离心10 min；将离心获得的血清分装后用于各项指标检测。记录LDL-C、HDL-C、TC、TG、ALT、AST、ALP、GGT、超敏C反应蛋白(hs-CRP)水平。根据CT影像学表现将NAFLD患者分为轻度(0.7<肝/脾CT比值<1.0)、中度(0.5<肝/脾CT比值≤0.7)和重度(肝/脾CT比值≤0.5)脂肪肝组。

1.3 Real-time PCR检测lncRNA EXOC7表达水平 采用TRIzol(Invitrogen，Grand Island，NY，USA)提取组织及血清标本中总RNA。将提取的总RNA参照AMV逆转录试剂盒说明书提供的方法反转录成cDNA。采用2×SYBR Green PCR Master Mix，以cDNA为摸板，进行Real-time PCR(7500型实时荧光定量PCR仪，Applied Biosystems公司，美国)。3次独立实验后得到的数据运用2-ΔΔCt方法进行分析。

2 结果

2.1 一般资料 共纳入120例NAFLD患者，其中非酒精性单纯性脂肪肝(NAFL)患者47例(男25例、女22例)，NASH患者73例(男43例、女30例)。对照组纳入50例患者(男25例、女25例)，其中轻型药物性肝损伤25例，慢性乙型肝炎25例。

两组一般资料比较，年龄、性别比差异均无统计学意义(P值均>0.05)，而BMI、腰臀比、HDL-C、LDL-C、TC、TG、ALT、AST、ALP、GGT、hs-CRP、胰岛素敏感指数(ISI)差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表1)。

2.2 lncRNA EXOC7表达情况 与对照组相比，NAFL和NASH患者的组织及血清中lncRNA EXOC7表达增高，差异均有统计学意义(P值均<0.05)；而lncRNA EXOC7在NAFL与NASH患者组织、血清中的表达差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表2)。

2.3 血清lncRNA EXOC7在不同程度非酒精性脂肪肝变性中的表达 lncRNA EXOC7的表达水平随肝脏脂肪变性及炎症程度的加重而升高(F=19.96，P<0.05)，其在轻、中、重度非酒精性脂肪肝患者血清中的表达均明显高于对照组(P值均<0.05)(图1)。

2.4 lncRNA EXOC7表达与临床生化指标的相关性 相关性分析结果显示，lncRNA EXOC7表达与TG、LDL-C水平呈正相关(r值分别为0.785、0.847，P值均<0.001)(图2a、b)；而与ISI和HDL-C水平呈负相关(r值分别为-0.709、-0.726，P值均<0.001)(图2c、d)。

2.5 lncRNA EXOC7表达对NAFLD的诊断价值 ROC曲线分析显示，lncRNA EXOC7诊断NAFLD的曲线下面积为0.812(95%可信区间：0.599～0.915，P<0.001)，敏感度为85.42%，特异度为81.17%(图3)。

表1 两组患者一般资料比较

表2 lncRNA EXOC7表达情况比较

注：与对照组比较，1)P<0.05。

图1不同程度NAFLD患者血清lncRNAEXOC7的表达

3 讨论

近年来NAFLD的发病率逐年上升且渐趋低龄化[9]。中国面临NAFLD和高脂血症的严重威胁，我国各类脂代谢紊乱患者约3亿人，患病率约25%。NAFLD是导致肝硬化、门静脉高压、肝移植及肝癌的重要原因[10]。对于超重和肥胖者而言，NAFLD的出现，可能提示“恶性肥胖”[11]，这类人群更易并发血脂异常症、糖尿病、高血压，从而导致冠心病、中风的概率显著增加。目前，NAFLD发病机制尚未完全阐明，治疗缺乏有效药物[12]。因此，阐明NAFLD发病机制并寻找有效的防治方法是目前临床亟待解决的难题。

lncRNA是一组长度>200 nt的不具有编码蛋白功能的RNA转录本，在表观遗传、转录、转录后水平发挥生理功能[13]。研究[14]发现lncRNA参与肝脏细胞多种生物学过程，在很多肝脏病理过程中发挥重要作用，与线粒体、内质网功能、能量代谢高度相关。在所有生物过程中，NAFLD发生变化最主要的3种生物过程，即RNA聚合酶Ⅱ启动、节律过程以及脂肪酸代谢过程，与lncRNA调控的翻译、羧酸转运、有机酸转运密切相关[15]。Chen等[16]发现，lncRNA-NEAT1通过调节miR-146a-5p/ROCK1促进NAFLD肝脏脂质积聚。下调lncRNA SNHG20的表达可通过调节肝Kupffer细胞极化延缓NAFLD向肝细胞癌的发展[17]。lncRNA FRRL2通过ARNTL-SIRT1通路减缓NAFLD的发生[18]。lncRNA NEAT1-Microrna-140 环通过阻断AMPK/SREBP-1信号促进NAFLD的发生[19]。lncRNA-H19通过直接调节miR130a/PPARγ轴促进NAFLD脂肪合成[20]。通过抑制MAPK信号转导通路中lncRNA HULC的表达可促进NAFLD大鼠肝纤维化和肝细胞凋亡[21]。lncRNA MIRT2通过海绵吸附miR-34a-5p，从而上调USP10的表达抑制肝脂肪变性[22]。lncRNA MEG3作为内源性竞争性RNA，通过竞争性结合miR-21到低密度脂蛋白受体相关蛋白6调节肝脏的脂肪生成[23]。以上研究均提示lncRNA在NAFLD中发挥着重要的作用。

本研究结果显示，lncRNA EXOC7在NAFLD患者组织及血清标本中表达明显增高，且表达水平随肝脏脂肪变性及炎症程度的加重而提升；进一步相关性分析发现，lncRNA EXOC7表达与TG、LDL-C呈正相关，而与HDL-C、ISI呈负相关。lncRNA EXOC7诊断NAFLD的ROC曲线下面积为0.812(95%可信区间：0.599～0.915)，敏感度为85.42%，特异度为81.17%。以上研究结果提示，lncRNA EXOC7可能是NAFLD防治的潜在新靶点。