海参低聚肽的高通量HPLC-MS/MS分析鉴定和活性筛选

左爱华1,王祖哲1,马 普1,刘心田2,孙天利1,赵林英1,包卫洋

(1.大连深蓝肽科技研发有限公司,辽宁大连 116000; 2.山东省威海市渔业技术推广站,山东威海 264200; 3.大连海洋大学 水产与生命学院,辽宁大连 116000)

海参作为珍贵的海洋生物,具有滋补效果好、营养及药用价值高等特点,属优质的蛋白源[1-2]。蛋白酶解法是目前获得小分子活性肽的主要方法,海参蛋白经过蛋白酶酶解后获得海参肽,海参肽在体内更易吸收且具有多种药理活性,如抗氧化、抗疲劳、降血压、降血糖、抗炎等[3-5],具有极大的应用潜力,成为小分子活性肽研究中的重点研究对象。

海参肽含有的活性肽段是决定其功效的主要因素,目前关于海参肽的研究多集中在酶解工艺和药理活性上,对其活性肽段及功效成分的研究较少[6]。仅有的关于海参中活性肽段的研究中多采用传统分离的方法,即经传统分离技术分离后获得单个活性肽再进行分析鉴定后测定活性的思路[7],如福州大学研究人员从海参肽中分离纯化获得的抗氧化肽malsvl[8]和kvlltflvv[9];Zhou等[10]获得的抗氧化肽GPEPTGPTGAPQWLR;宋淑亮等[11]分离纯化获得的促进NIH/3T3细胞增殖的海参肽SP12;以及其他研究人员获得的EVSQGRP、CRQNTLGHNTQTSIAQ、VSRHFASYAN等ACE抑制肽[12-13]。但采用此分离纯化的方法存在众多缺点,如效率低下、所需样品量多、分离纯化步骤繁琐、耗时费力,分离获得肽段有限以及功效不确定等[14]。因此,急切需要建立一种高效率且能够快速简便获得海参肽中多个活性肽段的方法。

液相色谱-质谱联用技术把色谱的分离能力和质谱的结构鉴定能力相结合,是蛋白质组学研究中常用手段,目前已逐渐应用于肽组学的分析及活性肽段的发现中[15-16],如用于乳蛋白水解物中活性肽的鉴定[17]、蔬菜蛋白酶解物中抗氧化肽的分析鉴定[18]等。此方法可以一次性分析鉴定多个肽段结构,与分离纯化方法相比具有极大的优势。在获得肽段结构信息的基础还需要进行活性筛选。目前小分子活性肽筛选主要方法有利用噬菌体库进行筛选、基于蛋白降解的筛选、基于MHC-多肽复合物的筛选、基于蛋白质结构及预测的筛选等[19-20]。这些筛选方法普遍存在的问题是耗费时间长,步骤繁琐,影响因素多,需要专业的或者经验丰富人员进行操作,普适性差。伴随大量活性肽的发现以及多肽数据库的构建,使得基于计算机辅助设计及构效关系的研究成为必然,利用在线构建的数据库及不同活性肽的构效关系进行活性筛选,在降低研究成本和周期的同时,大大提高活性肽筛选及研发成功的几率,非常适用于大量活性肽的前期筛选。

本文制备海参低聚肽并对其进行高效率、高通量的HPLC-MS/MS分析鉴定,获得其中肽段及蛋白质来源,并对其进行相对定量分析,在此基础上结合在线数据库及构效关系对获得肽段进行活性筛选,为海参肽中高活性肽段的发现及阐明其物质基础奠定基础,此方法也可用于其他来源的活性肽的分析鉴定及活性筛选,具有极大的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

复合蛋白酶制剂(150000 U/g) 南宁庞博生物工程有限公司;色谱级乙腈 默克公司;三氟乙酸 天津博迪化工股份有限公司;色谱级甲酸 美国Thermo fisher公司;刺参(Apostichopusjaponicus)大连鑫玉龙海洋生物种业科技股份有限公司。

Waters Nano ACQUITY高效液相色谱仪 美国waters公司;Q Exactive质谱仪 美国Thermo公司;冷冻离心机 上海医疗器械有限公司;匀浆机 上海标本模型厂;精密PH计 上海精密科学仪器有限公司;超滤装置 天津泰斯特仪器有限公司;真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 海参低聚肽的制备 新鲜刺参加入水制成匀浆液置于酶解罐中,刺参与水的质量体积比为1∶2,升温至50 ℃,加入2.5 mol/L的NaOH溶液调节pH至8.0,加入刺参质量分数0.2%的复合蛋白酶制剂(5000 g新鲜刺参需加入10 g复合蛋白酶制剂),在50 ℃下酶解4 h,酶解结束后升温至90 ℃灭酶10 min,获得刺参蛋白酶解液,蛋白酶解液以8000 r/min离心10 min,上清液采用截留分子量为3000 u超滤膜进行分离,过膜液浓缩后冷冻干燥得海参低聚肽。

1.2.2 海参低聚肽的HPLC-MS/MS分析鉴定

1.2.2.1 预处理 采用C18脱盐柱进行预处理,具体步骤为:C18脱盐柱预先进行活化平衡,将海参低聚肽溶解于含0.1%三氟乙酸的纯水(v/v),样品上样,先采用200 μL含0.1%三氟乙酸的纯水(v/v)进行清洗,然后采用200 μL 80%乙腈(含0.1%三氟乙酸,v/v)进行洗脱,收集洗脱液,冻干后采用HPLC-MS/MS进行分析鉴定。

1.2.2.2 色谱条件 色谱柱:C18(3 μm,100 Å,75 μm×15 cm);流动相A:0.1%甲酸水(体积比);流动相B:含0.1%甲酸的乙腈(体积比);梯度洗脱条件:0～15 min,5%～10% B,15～90 min,10%～30% B,90～103 min,30%～45% B,流速:600 nL/min;进样量:2 μg。

1.2.2.3 质谱条件 Q Exactive质谱仪;喷雾电压2.0 kV;毛细管温度320 ℃;S-lens RF Level 55;分辨率设置一级70,000@m/z 200,二级17,500@m/z 20;母离子扫描范围m/z 300～1500;MS1 AGC 3e6,离子注入时间60 ms;MS2 AGC 5e4,离子注入时间50 ms;离子筛选窗口2.2 m/z;碎裂模式HCD;Data-dependent MS/MS Top 20;动态排除时间30 s。

1.2.2.4 质谱数据定性和定量 采用Proteome Discoverer 2.1对采集的质谱数据进行数据检索,检索引擎使用Byonic,数据库使用Uniprot网站(www.uniprot.org)下载的holothuroidea数据库;数据库检索参数如下:无酶切;修饰:甲硫氨酸氧化,天冬酰胺及谷氨酰胺脱酰胺基修饰;母离子质量容忍度±10 ppm;碎片质量容忍度±0.02 u;蛋白Q值小于1%,其他参数为默认。同时对鉴定到的多肽抽提其色谱峰面积,进行相对定量分析。

1.2.3 活性筛选方法 PeptideRanker活性评分(http://bioware.ucd.ie/～compass/biowareweb/Server_pages/peptideranker.php);水溶性评定:采用Innovagen网站(http://www.innovagen.com/proteomics-tools);毒性评定:采用ToxinPred网站(http://crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/);抗高血压活性评定:采用AHTPin进行降压活性评分(http://crdd.osdd.net/raghava/ahtpin/),选择具体氨基酸个数下的Batch Submission,输入氨基酸序列,采用默认参数进行分析;采用AntiCP进行抗癌活性评分(http://crdd.osdd.net/raghava/anticp/index.html),采用Virtual Screening,输入氨基酸序列,默认参数进行分析[22]。

表1 海参低聚肽的HPLC-MS/MS 相对定量结果Table 1 Relative quantitative result of Apostichopus japonicus oligopeptides by HPLC-MS/MS

2 结果与分析

2.1 海参低聚肽HPLC-MS/MS分析鉴定结果

海参低聚肽经预处理后进行分析检测,基峰色谱图如图1所示,从图1中可以看出整个色谱梯度内色谱峰饱满,基峰色谱峰众多,分布均匀,显示色谱分离效果较高,且样本组成较为复杂。

图1 HPLC-MS/MS分析海参低聚肽中肽段的基峰色谱图Fig.1 Base peak chromatogram of peptides in Apostichopus japonicus oligopeptide by HPLC-MS/MS analysis

进一步经质谱鉴定最终获得海参低聚肽中多个肽段的氨基酸序列、相对分子质量、序列长度及液相保留时间,共鉴定到88个肽段,大部分肽段的长度在10个氨基酸以内,相对分子质量低于1000 u,且含有大量未经报道的活性多肽。通过多肽的丰度计算峰面积百分比进行相对定量分析,前30个高含量肽段的结果见表1,从表1中可以看出,肽段GFDGPEGPR的含量最高,占峰面积百分比的41.33%,其次为SRPQYPQYPS、GPAGPTGPTGPA、FDGPEGPR,分别占峰面积百分比为21.12%、10.79%、7.58%,它们是海参低聚肽中的主要肽段。

表2 海参低聚肽中肽段的来源蛋白质Table 2 Source proteins of the identified peptides in Apostichopus japonicus oligopeptide

表3 海参低聚肽中筛选获得的降压肽Table 3 Antihypertensive peptides screened in Apostichopus japonicus oligopeptides

同下载的海参蛋白数据库进行比对,结果显示鉴定到的肽段共来源于19种海参蛋白,丰度占前10位的蛋白质信息见表2,从表2中可以看出肽段来源的主要蛋白质为胶原蛋白、α-Ⅰ型胶原蛋白、富含甘氨酸胶原蛋白、Ⅱ型胶原纤维及细胞外基质蛋白3等,其中胶原蛋白占比为61.61%,α-Ⅰ型胶原蛋白占23.37%,查找两种蛋白的分子生物学功能,显示它们均是细胞外基质的结构成分,这也充分证实了海参体壁蛋白是以胶原蛋白为主[23-24]。

2.2 基于在线数据库的降压肽活性筛选

利用在线数据库对鉴定到的88个肽段进行活性评分、水溶性及毒性评定,选择活性评分≥0.7、水溶性好且无毒性的肽段,经过筛选后共获得10个肽段,进一步对10个肽段进行抗高血压和抗癌评分,结果见表3,从表3中可以看出,具有潜在抗高血压活性的肽段有9个,它们是KFPPPM、EKFPPPM、GPDGLPGPA、WEPPTFDGGRP、WEPPTFDGGRPI、KDNPSPPF、SNPSPPFE和FDGPEGPR,其中肽段KFPPPM的评分最高,但此肽段在海参肽中的含量很低,KFPPPM和EKFPPPM的核心序列为KFPPPM,WEPPTFDGGRP和WEPPTFDGGRPI的核心序列为WEPPTFDGGRP,KDNPSPPF和SNPSPPFE的核心序列为NPSPPF,而FDGPEGPR和海参低聚肽中含量最高的肽段GFDGPEGPR核心序列为FDGPEGPR。对筛选获得的10肽段进行抗癌活性评分,结果显示共8个肽段具有潜在的抗癌活性,其中7个肽段均具有潜在的降高血压及抗癌活性,而FDGPEGPR和KFPPPM显示出最强的抗癌活性和较好的抗高血压活性,具有潜在的开发及应用价值。

2.3 基于构效关系的ACE抑制肽活性筛选

目前已有文献报道海参肽具有降高血压及ACE抑制作用[25-27]。降高血压肽中很重要的一类是ACE抑制肽,ACE抑制肽的生物活性受肽段氨基酸组成、序列结构和长度的影响,众多学者对ACE抑制肽的构效关系进行研究[28-30],综合ACE抑制肽的构效关系,总结得出ACE抑制肽的筛选条件为:a. 一级氨基酸序列中含有大量疏水性氨基酸,疏水性氨基酸比例≥1/3。b. C末端倒数3个氨基酸残基中含有W、Y、F和P,或者C末端倒数第二个氨基酸为脂肪族氨基酸(如V、I、A)、碱性氨基酸(K、R、H)和芳香族氨基酸(F、Y、W),或C末端氨基酸为芳香族氨基酸(F、Y、W)、脂肪族及疏水性氨基酸(V、A、P、I、A、L、M)。c. N端存在芳香族氨基酸(F、Y、W)或碱性氨基酸(K、R、H)或者疏水性的氨基酸(G、A、I、V、L)。依据此筛选条件,对鉴定到的88个肽段进行筛选,得到具有潜在ACE抑制活性肽段:GFDGPEGPR、RPQYPQYPS、GPAGPTGPTGPA、GPAGPPGPPGAS、GPPGPPGPA、GIHVPGSP、GEDHIPGSP、KFPPPM、WEPPTFDGGRPI、WEPPTFDGGRP、RDYIPA、KDFNGIP、GHQGPR、GDDGPDGTPGP、HTPGDPVPL、HSGDALPDPPA,分析这些肽段可以看出,海参肽中的高含量肽段GFDGPEGPR(41.33%)和GPAGPTGPTGPA(10.79%)均具有潜在的ACE抑制活性,但是肽段的GPAGPTGPTGPA的水溶性较差,而肽段RPQYPQYPS和SRPQYPQYPS(21.12%)具有相同的核心序列 RPQYPQYPS,肽段KFPPPM、WEPPTFDGGRPI、WEPPTFDGGRP也是2.2中筛选获得的潜在降高血压肽。

结合2.2和2.3活性筛选结果,可以看出海参低聚肽中具有潜在降高血压活性的核心肽段有KFPPPM、WEPPTFDGGRP、NPSPPF、FDGPEGPR和RPQYPQYPS,经数据库检索这些肽段都是未经报道过的新肽段,后续可采用分离纯化或者化学合成来验证其降血压活性。

3 讨论与结论

海参原料来源、生产工艺及生产厂家不同,生产获得海参肽的分子量及所含肽段结构也各不相同,从而直接影响产品的理化性质、功效以及终端产品中的应用。本单位研究人员前期进行了大量海参肽生产工艺的研究,包括优化酶解工艺(包括蛋白酶、料液比、加酶量、酶解温度、pH、酶解时间)及生产流程等,得到海参低聚肽的最佳生产工艺,最终获得高水解度、高回收率及低分子量的海参低聚肽产品。分子量分布测试表明,海参低聚肽中相对分子质量小于1000 u的蛋白质水解物所占比例超过95%。进一步药理活性研究表明此海参低聚肽具有显著的抗衰老、抗疲劳、降血糖、补肾壮阳、抗炎及免疫调节等功效[31]。为了更好的阐明海参低聚肽的作用机制及所含的活性肽段,本文采用高通量的HPLC-MS/MS进行海参低聚肽的分析鉴定,并进行相对定量分析,共鉴定得到88个小分子肽段及19种来源蛋白质,且含有大量未经报道的小分子活性肽。在此基础上根据在线数据库对88个小分析肽段进行活性筛选,共获得9个潜在的降压肽,进一步依据ACE抑制肽的构效关系分析发现,核心肽段KFPPPM、WEPPTFDGGRP、NPSPPF、FDGPEGPR和RPQYPQYPS具有潜在的降压活性,为发现高活性的肽段和阐明海参低聚肽的物质基础奠定基础。

本文也建立了一种高效率、高通量分析鉴定海参低聚肽中肽段的方法,该方法采用C18固相萃取柱进行脱盐净化,清除了样品中的盐分和其他非蛋白质成分干扰,有效克服了高浓度盐对质谱检测的影响,使得小分子肽段得到净化和富集,尤其适用于低含量小分子肽的分析鉴定。本方法能够一次性分析鉴定多种小分子肽段的氨基酸序列并确定其蛋白质来源的优势,有效避免了分离纯化过程中耗时费力且只能获得单一肽的缺点。在此基础上,建立基于在线数据库和构效关系的高效、快速且简便的综合筛选小分子活性降压肽的方法,可用于大量小分子降压肽的初期筛选,大大简化活性肽发现流程,提高工作效率。该方法已应用于牡蛎肽等不同来源的活性肽中降压肽的发现,具有极大的应用价值,下一步工作可采用化学合成等方式对活性肽段验证或者进行计算机辅助结构修饰及药物设计等,有助于推进活性肽在医药领域的研究及应用。