白苏叶醇提物的鉴定及其对中式培根脂质氧化的影响

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(1.天津商业大学生物技术与食品科学学院,天津市食品生物技术重点实验室,天津 300134; 2.天津天狮学院食品工程学院,天津 301700)

白苏(Perillafrutescens),唇形科(Lamiaceae)紫苏属(Perilla)植物,是紫苏的近似种[1]。白苏与紫苏的最大区别是其叶片背面呈现白色,且全株密被白色长柔毛[2]。作为常见的药食同源植物,国内外的研究更多致力于紫苏,而忽略了同样资源丰富的白苏。白苏具有抑菌、抗氧化、抗衰老等作用,但前人对其研究主要集中于白苏茎叶中所富含的挥发油的成分[3-6]及其抑菌[7-9]、抗氧化活性[10]等,对于白苏黄酮类物质的报道甚少,主要是基于黄酮的提取条件及其优化[11-14]。Lee等[15]发现韩国白苏中含有芹菜素和芹菜素-7-氧-葡萄糖苷等黄酮类成分,并且白苏叶黄酮的抗氧化性能明显高于紫苏叶黄酮[16]。目前,白苏叶黄酮有待进一步的研究和开发。

中式培根是受消费者喜爱的一种腌腊肉制品,产品具有风味独特、营养丰富、保质期长等传统腌腊肉制品的优点[17]。然而,该产品生产周期长,欠缺系统规范的加工理论,导致质量不稳定。脂质氧化对腌腊肉制品风味特征的形成具有重要贡献,它是腊肉在盐腌、干燥和贮藏中风味形成的重要途径[18]。但是过度的脂质氧化会致使产品颜色、风味和质地变差,造成营养价值的损失,添加BHT等抗氧化剂是解决腌腊肉制品脂质过氧化的最常用的方法,但消费者对合成抗氧化剂抱有一定的抵触情绪,用天然抗氧化剂来替代合成的抗氧化剂或许是解决此问题最妥善的办法。黄酮类物质是常见的天然抗氧化剂,而资源丰富的白苏叶资源又富含黄酮类成分,有望作为成本较低、绿色环保的天然抗氧化剂添加于腌腊肉制品。

前期实验对乙醇微波辅助提取白苏叶黄酮的条件进行了优化,并利用大孔树脂对黄酮进行了纯化[19]。基于此,本文对白苏叶醇提物成分进行鉴定,探索其作为天然抗氧化剂在中式培根加工中的应用,旨在解决影响中式培根质量的脂质过度氧化问题,为白苏的开发利用及白苏黄酮作为天然抗氧化剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白苏叶 河北省安国市祁澳中药饮片有限公司,粉碎至约20目;五花肉 天津华润万家超市;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(分析纯)、甲醇(色谱纯) 美国Sigma公司;甲酸(色谱纯) 美国Tedia公司;原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸(纯度均>98%)天津一方科技公司;柠檬酸(纯度>99%) 天津市化学试剂一厂;丹参素(纯度>98%) 成都西亚化工股份有限公司;原儿茶酸、野黄芩苷(纯度均>98%) 上海晶份有限公司纯生化科技;AB-8大孔树脂 南开大学化学工厂。

Agilent 6520 LC-Q-TOF液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(LC-Q-TOF-MS)及Agilent G6410A LC-MSD QQQ液相色谱-三重四级杆串联质谱(LC-MS/MS) 美国Agilent公司;BP211D十万分之一天平 德国Satorius公司;Lambda 25紫外可见分光光度计 美国Perkin-Elmer仪器有限公司;DH4000BⅡ电热恒温培养箱 天津市泰斯特仪器有限公司;FD-2冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;Grace Reveleris TM全息快速纯化色谱系统 美国Alltech公司;SSI 1500型高效液相色谱 美国Alltech公司;H2050R-1医用离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 7种标准品包括柠檬酸、丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、野黄芩苷和迷迭香酸,使用甲醇溶解后混合,其中各标准品终浓度均为0.005 mg/mL,使用时逐级稀释至所需的浓度。

1.2.2 白苏叶醇提物的纯化 按照作者之前的研究[19],以63%的乙醇为溶剂,利用微波辅助提取法(提取条件为:乙醇浓度63%、液料比41∶1 mL∶g、微波温度72 ℃、提取时间7 min以及微波功率500 W)提取白苏叶黄酮,并利用AB-8大孔树脂进行纯化(白苏叶纯度为53.10%)。冷冻干燥得到白苏叶醇提物粉末备用。使用甲醇配制4 mg/mL的白苏叶醇提物样品液,经制备色谱分离纯化初步得到2个组分,以下简称组分1和组分2(制备色谱具体分离纯化条件见文献[19]),测试样品经甲醇溶解后用0.22 μm微孔滤膜过滤。

1.2.3 白苏叶醇提物成分的定性定量分析 色谱条件:ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱温30 ℃,进样量5 μL。流动相A、B均为含有0.1%甲酸的甲醇溶液和水溶液,流速0.3 mL/min,进行梯度洗脱:0～30 min,40%～75% A,30～35 min,70%～75% A。质谱条件:Q-TOF为电喷雾Dual-ESI离子源,负离子模式,离子源温度350 ℃,干燥气流速为10 L/min,数据采集范围m/z=100～1000,毛细管电压3500 V,碰撞电压175 V,Skimmer电压35 V;MS/MS为电喷雾ESI负离子源温度350 ℃,喷雾电压4000 V,雾化气及碰撞气均为高纯氮气(纯度>99.99%),流速10 L/min,雾化气压力和碰撞气压力分别为35 Psi和0.15 MPa。

定量分析采用HPLC-MS/MS的多重反应监测模式(MRM)对白苏叶成分的特征碎片离子进行检测,其中,具有标准品的7种物质采用标准曲线法进行定量;对无法购得标准品的其余6种物质,峰4、6、7、10和11则使用与其结构相近的黄酮类化合物野黄芩苷作为对比物进行对比定量法定量,即计算这些物质的含量是基于野黄芩苷的当量,峰8为迷迭香酸二聚体,则使用迷迭香酸进行对比定量。

1.2.4 白苏叶醇提物成分对中式培根脂质氧化的影响 参照文献[20]的方法,于超净工作台内将五花肉切割成相同的大小(每块约150 g),并随机分成四组,所用刀具和菜板均使用75%乙醇进行表面杀菌。每块肉表面均匀涂抹食盐进行腌制(用盐量为2.0%),三个实验组肉表面分别涂抹三个浓度0.01%、0.02%、0.05%(溶剂为63%乙醇和乙酸乙酯,1∶1)的纯化后的白苏叶醇提物,作为溶剂对照组的肉表面涂63%乙醇和乙酸乙酯(1∶1,少量乙酸乙酯的使用为了使黄酮更易涂抹和滞留于肉的表面)。之后经过3 d的腌制期和18 d的发酵期。腌制温度4 ℃,相对湿度85%;发酵初期25 ℃保持5 d,随后发酵成熟期温度以1.5 ℃/d的速率匀速升至40 ℃,相对湿度从85%以0.5%/d的速率匀速降至79.5%后保持不变。分别于腌制结束(3 d)、发酵中期(8 d)、成熟中期(13 d)、成熟结束(18 d)取四组样品的表面脂质部分,放入绞肉机中绞碎混匀,测定其脂质氧化指标(取样工艺点具体指标见表1)。丙二醛(MDA)和过氧化值(POV)均根据国标法进行测定[21-22]。其中丙二醛的标准曲线为A532 nm=1.665C-0.0156(R2=0.9906)。

表1 取样工艺点平均温湿度Table 1 Average daily temperature and humidity of sampling days

表2 白苏叶中主要成分的标准曲线Table 2 Standard curves of the main components in Perilla frutescens leaves

注:“-”:表示无相应的结果；表3同。

1.3 数据统计分析

使用Agilent MassHunter工作站软件-定量分析程序(B.07版本)进行白苏叶醇提物成分的定量数据分析,使用SPSS(16.0版本)进行数据的统计分析。所有测定平行进行3次。

2 结果与分析

2.1 白苏叶醇提物成分的定性定量分析

2.1.1 白苏叶醇提物成分的定性分析 利用LC-Q-TOF-MS和LC-MS/MS从白苏叶醇提物中鉴定了13种成分,总离子流图见图1。

混合标准品溶液在相同条件下也进行质谱分析,7个标准品与相应的样品成分具有一致的保留时间、母离子以及二级质谱碎片离子,从而确定了白苏叶成分中的7种物质,分别是柠檬酸(峰1)、丹参素(峰2)、原儿茶酸(峰3)、原儿茶醛(峰5)、咖啡酸(峰9)、野黄芩苷(峰12)和迷迭香酸(峰13)。白苏叶主要成分分析的标准工作曲线和定性定量分析结果分别见表2和表3。对于图1中无标准品的成分,则通过二级质谱图谱解析并结合相关文献进行鉴定。

图1 白苏叶醇提物组分1(A)、组分2(B) 和标准品溶液(C)的总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms of fraction 1(A) and fraction 2(B)of the ethanol extract from Perilla frutescens leaves and standards(C)

其中峰4的分子离子峰[M-H]-为593.2,该化合物的分子式为C27H30O15,它的二级质谱具有m/z 472.8、383.0和353.0,由此判断出该化合物中含有两个六碳糖[23]。根据文献[24],推断该化合物为芹菜素-6,8-二-C-葡萄糖苷。

表3 白苏叶中主要成分的定量分析结果Table 3 Quantitation analysis results of the main components in Perilla frutescens leaves

峰6和峰7的分子离子峰[M-H]-均为m/z 637.2,由精确质量推测其分子式为C27H26O18。二者的二级质谱图中有m/z 350.6、284.9以及350.8、284.8的碎片峰,推断二者应为同分异构体。根据文献[25-26]推断此二种化合物为野黄芩素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷和木犀草素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷。

峰8的一级质谱显示分子离子峰[M-H]-为m/z 719.4,化学式为C36H32O16。其二级质谱显示m/z 359.4、178.7和160.7的碎片离子,这些碎片离子表明此化合物与迷迭香酸(m/z 359.1)有相似的结构特征,故推断其为迷迭香酸二聚体。

峰10的一级质谱显示分子离子峰[M-H]-m/z 621.2,分子式为C27H26O17。它的二级质谱具有m/z 351.0、268.8和192.9的碎片离子。根据文献[27]推断该化合物为芹菜素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷。

峰11的分子离子峰[M-H]-为447.2,通过对比其和木犀草苷的二级质谱信息,样品中m/z 447.2的质谱峰与m/z 447的木犀草苷具有相同的母离子与碎片离子,但峰11的保留时间为19.228 min,相同条件下木犀草苷的保留时间为20.811 min,故推断此化合物为木犀草苷的同分异构体野黄芩素-7-氧-葡萄糖苷。

2.1.2 白苏叶成分的定量分析 具有标准品的7种物质采用标准曲线法进行定量,标准曲线及定量结果详见表2、表3;对无标准品的其余6种物质,峰4、6、7、10和11则使用野黄芩苷作为对比物进行对比定量法定量,峰8为迷迭香酸二聚体则使用迷迭香酸进行对比定量,定量结果亦见表3。结果可知,组分1和2的主成分分别为柠檬酸和迷迭香酸,由峰面积计算可得且各占其组分含量的28%和41%,此外,经计算组分1和2含黄酮类物质约为39%和53%。在一定的浓度范围内,7种标准品的线性良好,决定系数介于0.987～0.999,检出限介于0.37～6.3 ng/mL,回收率介于97.1%～109.5%,证明此法具有较高的灵敏度、精密度以及准确性。本实验结果(表3所示含量最高的为迷迭香酸和野黄芩苷)与前人对紫苏叶黄酮的研究进行对比发现,白苏叶与紫苏叶含量较多成分均为迷迭香酸、野黄芩苷,但其余成分有所差别,如胡军华等[28]和胡惠军等[29]分别得出不同产地紫苏叶咖啡酸、野黄芩苷以及迷迭香酸的含量分别介于0.1081～0.4999、0.2727～4.3820和0.4315～9.5850 mg/g,这主要是由于产地、提取方法、定量分析方法等不同造成的。代沙等[30]的实验亦表明,紫苏以迷迭香酸和咖啡酸为主要酚酸类成分,槲皮素和芹菜素为主要黄酮类成分。

2.2 白苏叶醇提物成分对中式培根在加工制作过程中脂质氧化的影响

2.2.1 白苏叶醇提物成分对中式培根加工过程中丙二醛(MDA)的影响 MDA作为衡量脂质氧化二级产物、油脂酸败的指标[31],含量越高说明脂质氧化程度越高。在中式培根加工过程中总体随时间延长呈现上升趋势(见图2),由此可见脂质氧化是伴随整个加工过程。随着天数的推移以及温度与湿度的变化,中式培根的脂质氧化程度逐渐加深。而涂抹0.05%白苏叶醇提物的中式培根样品的丙二醛含量全程均显著低于对照组,且低于其他两组中、低浓度的抗氧化处理组(P<0.05)。对照组丙二醛含量明显高于经过白苏叶醇提物涂抹处理的实验组,而丙二醛含量高低反映的是腌腊肉制品脂肪氧化酸败程度[32],可见白苏叶醇提物的添加对肉类脂质氧化有一定的抑制作用,并且不同浓度的白苏叶醇提物的抗氧化能力表现出不同,白苏叶醇提物浓度越大,对脂质氧化的抑制作用越明显。使用0.05%的白苏叶醇提物酮处理中式培根时,可以有效抑制中式培根的脂质氧化。

图2 白苏叶醇提物对中式培根加工过程中 丙二醛(MDA)含量的影响Fig.2 Effects of the ethanol extract from Perilla frutescens leaves on the malondialdehyde(MDA)content in Chinese bacon during the production process 注:不同小写字母代表相同时间不同浓度白苏叶醇提物的 添加对MDA含量的影响差异显著(P<0.05),图3同。

图3 白苏叶醇提物对中式培根加工过程中 过氧化值(POV)的影响Fig.3 Effects of the ethanol extract from Perilla frutescens leaves on the peroxide value(POV)in Chinese bacon during the production process

2.2.2 白苏叶醇提物成分对中式培根加工过程中过氧化值(POV)的影响 中式培根的POV在加工过程中总体呈上升趋势(见图3)。POV值是用来衡量脂肪初级氧化产物—氢过氧化物(HPOD或称为ROOH)尤其是过氧化氢的重要参数,是反映脂肪初级氧化程度的重要指标[33]。中式培根的腌制过程中POV值明显上升,这可能与腌制过程温度逐渐升高有关,温度的升高可以加速脂质氧化。闫文杰等[34]研究显示,金华火腿腌制时过氧化值不断上升,与本研究结果一致。但是,在王超[20]的研究中,经迷迭香等抗氧化物质处理的腌腊肉中的POV值在加工过程中有升有降,发酵中期有下降现象,但总体呈现上升趋势。本研究中没有明显的POV值下降的现象,原因可能是由于发酵初期温度较高,脂质氧化速度较快,测样取点时间间隔错过了POV值明显下降的点。对照组中腌制以及发酵初期过氧化值上升剧烈,脂质初级氧化迅速,而涂抹白苏叶醇提物的各处理组POV值虽有所上升,但相对于对照组趋势明显偏缓,这说明了白苏叶醇提物的涂抹有效抑制了脂质表层的初级氧化。其中涂抹0.05%白苏叶醇提物中式培根的POV值整体上升趋势均偏缓,且在腌制结束时,各组POV值顺序为:对照组>0.01%白苏叶醇提物处理组≥0.02%白苏叶醇提物处理组>0.05%白苏叶醇提物处理组(P<0.05)。经过白苏叶醇提物处理的POV值明显低于对照组,且随白苏叶醇提物的添加量的增加而降低,说明经过白苏叶醇提物处理的中式培根样品的脂质氧化程度被有效抑制,并且与白苏叶醇提物的浓度呈现正相关。本实验采用的是白苏叶醇提物进行中式培根的脂质氧化抑制实验,且由组分鉴定结果组分1和组分2的主成分分别为柠檬酸和迷迭香酸,且组分1的黄酮类物质含量低于组分2(表3),柠檬酸供氢能力较弱,是常见的金属螯合剂,而迷迭香酸以及黄酮类物质均具有多个酚羟基结构,故推断组分2比组分1具有更好的抗氧化活性,将来可分别使用组分1和2结合黄酮标准品分别进行抑制培根氧化实验,进一步探讨黄酮具体组分的可能作用机制。本实验中对白苏叶醇提物的添加组与未添加组进行了比较,添加组的POV值和丙二醛值均在国家标准的控制之内。事实上,若实验中采用常见的食用抗氧化剂如VC和BHT等作为阳性对照,结果则更具有说服力。

3 结论

本实验首次从白苏叶醇提物中鉴定出13种物质为迷迭香酸、野黄芩苷、柠檬酸、芹菜素-6,8-二-C-葡萄糖苷、丹参素、木犀草素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷、野黄芩素-7-氧-葡萄糖苷、迷迭香酸二聚体、野黄芩素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷、咖啡酸、原儿茶酸和原儿茶醛。并将白苏叶醇提物应用于中式培根加工中,经过白苏叶醇提物处理的中式培根试样在发酵成熟结束时,丙二醛和过氧化值均显著低于对照组(P<0.05),说明了白苏叶醇提物处理有效地抑制了中式培根的脂质氧化程度,抗氧化程度明显,并且在质量浓度范围为0～0.05%时,白苏叶醇提物的添加量越多,抑制效果越好。资源丰富的白苏叶天然、安全,作为天然防腐剂具有明显优势。本研究通过对白苏叶醇提物成分进行分析鉴定并进一步将其应用于抑制中式培根加工过程中的脂质氧化,为白苏叶资源的进一步开发利用奠定了理论基础。