不同植物精油对大米青霉和黑曲霉的抑菌效果

(中南林业科技大学食品科学与工程学院,湖南长沙 410004)

我国是大米生产大国,但每年在储藏过程中因霉变而造成的损失巨大[1]。研究表明,植物精油对植物病原菌具有很好的抑菌效果[2-3]。植物精油(Essential oils)是存在于植物组织中的一类次生代谢物质,主要化学成分有单萜、倍半萜烯、酯、醛、酮、醇等,常温下多为油状液体,易挥发,具有强烈的香味和气味[4]。

我国精油资源非常丰富,具有开发利用价值的植物种类多达60多个科,400多个种[5]。很多植物精油不仅抗菌活性强,且在控制剂量的前提下安全性好[6-7]。有研究表明,复合植物精油防霉剂可有效防控玉米储藏过程中霉菌和真菌毒素污染[8],曲春阳[9]的研究证实,大蒜与肉桂复合精油对大米黄曲霉(Aspergillusflavus)具有很好的抑制效果。但植物精油对引起大米霉变常见的青霉和黑曲霉抑制效果如何,相关报道甚少。

本文以大米青霉和黑曲霉为供试菌,以抑菌圈直径、最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)、最低生长下降浓度(Minimum growth decrease concentration,MGDC)和联合抑菌效果为指标,对9种植物精油的抑菌效果进行评价,对抑菌效果较佳的精油进行复配,据此筛选具协同抑菌效果的精油组合,以期为大米防霉复合植物精油保鲜剂的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

孜然精油、丁香精油、山苍子精油、薄荷精油、花椒精油、香茅精油、迷迭香 分析纯,江西雪松天然药用油有限公司;蓝桉叶精油 分析纯,江西省广博香料油有限公司;肉桂精油 分析纯,武汉盛世精细化学品有限公司;青霉(Penicillium)、黑曲霉(Aspergillusniger) 购于广东省微生物研究所。PDA培养基 实验室自制。

RGX-150人工气候培养箱、MJX-250B霉菌培养箱、ZX-260立式压力蒸汽灭菌器 北京中兴伟业有限公司;SW-CJ超净工作台 上海新苗医疗机械制造有限公司;BX-53显微镜 日本奥林斯基。

1.2 实验方法

1.2.1 抑菌圈的测定 采用滤纸片法[10]。量取不同精油,加入丙酮稀释,制得浓度为200 μL/mL的精油丙酮混合液供试验。无菌条件下,在无菌平皿中倒入培养基,待培养基凝固后,取0.1 mL浓度为106～107CFU/mL的霉菌悬液涂布于平皿培养基上,使之成为含菌平板。在无菌条件下,于每个培养皿中间贴3片圆滤纸片(d=6 mm),使之呈三角状排列,每片滤纸上滴入 5 μL上述精油丙酮混合液,培养皿用保鲜膜密封。在37 ℃下分别培养36、48、72 h,观察并测量抑菌圈直径。并设空白对照,每个试验重复3次。

抑菌圈试验判定标准(培养至第36 h进行评价):抑菌圈直径>20 mm,高度敏感;10～20 mm,中度敏感;5～10 mm,低度敏感。

1.2.2 不同植物精油的协同抑菌效果 为探究优选出的不同精油的协同抑菌效果,将不同精油原油分别等体积混合后,采用滤纸片法,精油不稀释,每个培养皿在中央放置一片圆形滤纸(d=6 mm),滴加复合精油2.5 μL,其他操作同1.2.1,在37 ℃下分别培养36 h后,测定不同组合对青霉和黑曲霉的抑制圈直径。每个试验重复3次。

1.2.3 最低生长下降浓度(MGDC)试验 参考曲春阳[9]的方法。精油浓度起点低于MIC试验,其他方法与MIC试验相同,以考察微生物出现明显生长下降的最低浓度。每个试验重复3次。

1.2.4 联合抑菌效果评价 以分级抑菌浓度(Fractional inhibitory concentration,FIC)指数[9,12]作为联合抗菌试验效果的判定依据。

FIC指数判定标准:FIC指数≤0.5时为协同作用;0.52.0时为拮抗作用。

1.2.5 不同配比复合精油对青霉、黑曲霉的抑制作用的测定 对协同抑菌效果最好的精油组合分别按照1∶7、1∶3、1∶3、1∶1、3∶1、5∶1、7∶1的体积比两两复配,复合精油用0.22 μm的微孔过滤器过滤,加入Tween-80作为乳化剂,用丙酮溶液稀释。在无菌操作下,吸取一定体积的精油稀释液与无菌培养基均匀混合,置于培养皿中冷却凝固,制成含相应精油浓度的培养基。将0.1 mL浓度为106～107CFU/mL的菌悬液均匀涂抹于有培养基上,倒置培养,于28 ℃培养96 h,以不生长菌的最低浓度为精油的最小抑菌浓度MIC[11]。每个试验重复3次。

1.3 数据处理

数据通过SPSS 12.0 软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。每次试验均设置三次重复。

2 结果与分析

2.1 单一植物精油对大米青霉和黑曲霉的抑菌效果

9种植物精油对大米青霉和黑曲霉的抑菌效果见表1。由表1可见,丁香、肉桂精油对大米青霉的抑菌圈直径在72 h内都大于20 mm,而孜然精油在36 h内大于20 mm,说明青霉对这3种精油高度敏感。山苍子精油在48 h内对青霉的抑菌圈直径在10～20 mm之间,表明青霉对其中度敏感,而花椒、香茅和迷迭香精油的抑菌效果相对较差,72 h后滤纸片被霉菌完全覆盖,这与李国林等[13]的研究结果有相似之处。

丁香、肉桂精油对黑曲霉的抑菌圈直径在72 h内均大于20 mm,表明黑曲霉对其高度敏感,具有很好的抑菌效果,而蓝桉叶、山苍子、薄荷精油的抑菌圈直径48 h内在10～20 mm之间,黑曲霉对其中度敏感,具有较好的抑菌效果,其他精油则抑菌效果较差。

由此可见,肉桂和丁香精油在9种植物精油中对青霉和黑曲霉的抑制效果最好,其次为山苍子精油和蓝桉叶精油,而孜然精油对青霉也有较好效果。

植物精油能抑制微生物的生长繁殖,原因在于其含有特定的功效成分。周明等[14]的研究表明,肉桂精油的主要成分为反式肉桂醛、肉桂醛和2-甲氧基肉桂醛,肉桂醛具有杀菌消毒防腐的功能,对真菌的效果特别显著。肉桂醛通过破坏真菌的细胞壁,使外源活性成分可渗入真菌细胞内,破坏细胞器而起到杀灭真菌的作用。李宁等[15]和邱电等[16]的研究表明,丁香精油对食品中常见的霉菌均有不同程度的抑制作用,丁香精油的抗菌有效成分主要是丁香酚,丁香酚与大多数抗真菌药物作用机理相似,主要通过破坏真菌的细胞膜达到抑制和杀灭真菌的作用。顾仁勇等[17]的研究发现,山苍子精油的主要成分有右旋萜二烯、桉叶油醇和芳樟醇,这些成分均有良好的抑菌效果。

表1 9种植物精油对大米青霉和黑曲霉的抑菌效果Table 1 Antimirobial effect of nine kinds of plant essential oils against Penicillium and Aspergillus niger

注:“-”表示无抑制作用。以上数据均为平均值±标准差(n=3);表2同。

表3 肉桂、山苍子精油及复合精油对大米青霉、黑曲霉的MGDC、FICTable 3 The MGDC and FIC of mixture of essential oils from cinnamon and litsea cubeba against Penicillium and Aspergillus niger

注:FIC为3次重复的平均值,MGDC为平均值±标准差(n=3);表4同。

表4 肉桂、丁香精油及复合精油对青霉、黑曲霉的MGDC、FICTable 4 The MGDC and FIC of mixture of essential oils from cinnamon and clove against Penicillium and Aspergillus niger

2.2 不同植物精油对大米青霉和黑曲霉的协同抑菌效果

优选复合植物精油对大米青霉和黑曲霉的抑菌圈直径测定结果见表2。由表2可知,在单一精油中,无论是对青霉还是黑曲霉,肉桂精油的抑菌效果最好,其次为丁香,山苍子精油最差,三者均存在显著差异(P<0.05),其原因在于肉桂精油的主要抑菌成分肉桂醛具有很强的抑制霉菌作用,其不仅能抑制孢子的萌发,还能抑制菌丝体生长和孢子的产生[18]。由于肉桂醛的挥发性比丁香酚低,因此抑菌效果比丁香酚更稳定、持久[19]。将此三种植物精油全组合在一起及两两组合后,其对青霉和黑曲霉抑菌效果最好的为C组合(肉桂精油+山苍子精油),B组合(肉桂精油+丁香精油)其次,而含三种精油的A组合并未展示出最强的抑菌活性,位列第三,各组合之间均存在显著差异(P<0.05)。肉桂精油与山苍子精油(C组合)、肉桂精油与丁香精油(B组合)复配后,其对青霉和黑曲霉的抑菌效果均显著(P<0.05)优于单一精油,显示出极佳的协同增效作用。Júlia等[20]在用蓝桉叶与巨尾桉叶复合精油对变形链球菌的抑菌试验中也发现,两种精油具有良好的协同增效作用。

表2 优选植物精油复合对大米青霉和黑曲霉的抑制效果Table 2 Antimirobial effect of recombination of essential oils selected against Penicillium and Aspergillus niger

注:同一列标有不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)。

分别对肉桂与山苍子精油、肉桂与丁香精油对大米青霉、黑曲霉的MGDC 和FIC进行测定,结果如表3、表4所示。由表3可见,肉桂精油和山苍子精油等体积混合后,其抑制青霉和黑曲霉的FIC值均小于0.5,进一步说明肉桂精油和山苍子精油复配对青霉和黑曲霉的抑菌效果具有极佳的协同效应。其对青霉和黑曲霉的MGDC值比单一精油明显下降,也充分佐证了这一点。

由表4可知,肉桂和丁香精油等体积混合后,抑菌效果明显提高,其对青霉和黑曲霉的抑菌FIC值均小于0.5,MGDC也明显降低,说明二者也存在协同增效作用,但效果较肉桂和山苍子精油组合略差。

2.3 不同配比复合精油对青霉、黑曲霉的抑制作用

肉桂和山苍子精油,肉桂和丁香精油等体积混合后,展示出很好的协同抑菌效果,为了探明复合精油的最佳比例,对不同比例复合精油进行对比试验,筛选出效果最好的配方。

不同配比复合精油对青霉和黑曲霉的MIC分别见图1和图2。由图1可以看出,对黑曲霉而言,当肉桂精油与丁香精油的比例由1∶7向1∶3变化时,其抑菌效果会随着丁香精油占比的降低而提高,在1∶3时抑菌活性最强,继续由1∶3向7∶1变化时,其抑菌效果会随着肉桂精油占比的增加而降低;对青霉而言,变化趋势与对黑曲霉的大体相同,但MIC最低值出现在两者比例为1∶1时。

由图2所知,肉桂精油与山苍子精油体积比为3∶1时对青霉和黑曲霉抑菌效果最好,MIC均为0.1 μL/mL。但图2却有两个相对低点,分别出现在肉桂和山苍子精油的比例为3∶1和1∶3时,说明这两种精油协同抑菌时,可能是以一种为主导一种为辅的形式。当以肉桂精油为主导时,即当比例在7∶1到1∶1之间时,3∶1的比例抑菌效果最明显;而当以山苍子精油为主导时,即当比例在1∶1到1∶7之间时,1∶3的比例又是效果最好的。相对而言,以肉桂精油为主导的配比效果最佳,即肉桂与山苍子精油体积比为3∶1时,对青霉和黑曲霉的MIC均为0.1 μL/mL。综上所述,肉桂精油和山苍子精油的体积比为3∶1,对大米中的青霉、黑曲霉具有较好的抑制效果。

图1 不同配比肉桂与丁香复合精油 对青霉和黑曲霉的MICFig.1 The MIC of different ratio of essential oil from cinnamon and clove against Penicillium and Aspergillus niger

图2 不同配比肉桂与山苍子复合精油 对青霉和黑曲霉的MICFig.2 The MIC of different ratio of essential oil from cinnamon and litsea cubeba against Penicillium and Aspergillus niger

3 结论

在9种供试植物精油中,肉桂精油和丁香精油对青霉和黑曲霉的抑菌效果最佳,山苍子精油和蓝桉叶精油次之。在复合精油中,肉桂精油和山苍子精油组合的抑菌效果最好,说明两者的协同增效性最佳,且当肉桂精油与山苍子精油的体积比为3∶1时,该复合精油对青霉和黑曲霉的抑菌效果最好,其MIC仅为0.1 μL/mL。故肉桂与山苍子精油按适当比例复配,可作为一种具良好应用前景的大米防霉保鲜剂。